1. 1 實驗動物
SPF 級健康成年Sprague Dawley ( SD) 雄性大鼠82 只，鼠齡8 周，體質(zhì)量180 ～ 200 g，購自北京維通利華實驗動物中心，實驗動物許可證號: SCXK( 京) 2016－ 0011。正常飲食，實驗環(huán)境清潔，溫度25 ℃，晝夜交替12 h，飼養(yǎng)1 周以適應環(huán)境，每籠2 ～ 3 只。本實驗通過首都醫(yī)科大學動物倫理委員會批準( 倫理批號: AEEI-2018－017) 。東莨菪堿對大鼠強迫游泳行為和曠場實驗的影響及其作用靶點
1. 2 主要藥品及試劑
微量給藥套管購自瑞沃德公司; 微量進樣針購自上海高鴿公司; Scopolamine hydrobromide 購自英國Tocris 公司( 批號: 114－49－8) ; Methoctramine hydrate ( 批號: 104807－46－7) 和Muscimol hydrobromide( 批號: 18174 － 72 － 6) 購自美國Sigma 公司。東莨菪堿對大鼠強迫游泳行為和曠場實驗的影響及其作用靶點
1. 3 主要儀器
東莨菪堿對大鼠強迫游泳行為和曠場實驗的影響及其作用靶點強迫游泳有機玻璃缸( 水深37 cm，桶高50 cm，直徑30 cm) 購自武漢普百康科技發(fā)展有限公司。大鼠強迫游泳分析軟件EthoVisionXT10 購自荷蘭Noduls公司。曠場實驗分析系統(tǒng)( 100 cm × 100 cm × 40 cm，底部為黑色，四周壁為黑色，無蓋不透明塑料方箱) 購自上海欣軟信息科技有限公司。
1. 4 實驗方法
1. 4. 1 動物分組及處理
1) 通過強迫游泳實驗明確東莨菪堿的抗抑郁樣作用: 將14 只正常SD 大鼠采用數(shù)字表法隨機分為東莨菪堿組和對照組，每組7 只，分別腹腔注射25 μg /kg 東莨菪堿或等體積0. 9% ( 質(zhì)量分數(shù)) 氯化鈉注射液，24 h 后通過曠場實驗和強迫游泳實驗評價東莨菪堿對大鼠抑郁樣行為的影響。東莨菪堿對大鼠強迫游泳行為和曠場實驗的影響及其作用靶點
2) 利用γ-氨基丁酸-A ( γ-aminobutyric acid-A，GABA-A) 受體激動劑蠅蕈醇( Muscimol) 沉默內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)( medial prefrontal cortex，mPFC) 神經(jīng)元以明確東莨菪堿發(fā)揮抗抑郁效應的腦區(qū): 將14 只正常SD大鼠采用數(shù)字表法隨機分為Muscimol + 東莨菪堿組和東莨菪堿組，每組7 只，在腹腔注射25 μg /kg 東莨菪堿前1 h 分別向大鼠mPFC 立體定位注射Muscimol1. 25 μg 或等體積0. 9% ( 質(zhì)量分數(shù)) 氯化鈉注射液，24 h 后進行強迫游泳實驗觀察東莨菪堿的行為學效應是否被阻斷。
3) 通過M2受體選擇性拮抗劑MCT 側(cè)腦室注射以明確M2受體是東莨菪堿抗抑郁的作用靶點: 將大鼠分為對照組和MCT 組，分3 批次分別向大鼠側(cè)腦室注射0. 5 μg / 2 μL( 對照組和MCT 組各9 只) 、1 μg /2 μL( 對照組7 只，MCT 組10 只) 和2 μg /2 μLMCT( 對照組9 只，MCT 組10 只) ，對照組均給予2 μL0. 9%( 質(zhì)量分數(shù)) 氯化鈉注射液。24 h 后利用曠場實驗和強迫游泳實驗評價大鼠行為學變化。東莨菪堿對大鼠強迫游泳行為和曠場實驗的影響及其作用靶點
1. 4. 2 手術和給藥
動物稱體質(zhì)量后，用1% ( 質(zhì)量分數(shù)) 比妥溶液0. 5 mL /100 g腹腔注射麻醉。根據(jù)大腦立體定位圖譜將套管埋置于雙側(cè)mPFC( 前囟前2. 8 mm，旁開3. 1 mm，深度3. 8mm，傾斜30°角) 或者側(cè)腦室( 前囟后0. 9mm，旁開1. 5 mm，深度3. 5 mm) 。大鼠術后休息1 周后，通過微量給藥系統(tǒng)經(jīng)套管向雙側(cè)mPFC 注射Muscimol 或等體積0. 9% ( 質(zhì)量分數(shù)) 氯化鈉注射液，向雙側(cè)側(cè)腦室注射不同劑量MCT 或2 μL 0. 9%( 質(zhì)量分數(shù)) 氯化鈉注射液，給藥速度均為0. 2 μL /min，給藥后留針5 min。東莨菪堿對大鼠強迫游泳行為和曠場實驗的影響及其作用靶點
1. 4. 3 曠場實驗
用來評定大鼠自發(fā)性活動能力。提前將大鼠搬入測試室，使大鼠適應環(huán)境至少1 h。將大鼠放入曠場設備中心后，開始記錄5 min 內(nèi)大鼠在曠場內(nèi)總路程，每次實驗結(jié)束用稀釋的乙醇徹底清潔曠場。測試過程采用SuperMaze視頻記錄分析軟件( 上海欣軟信息科技有限公司)記錄并分析。東莨菪堿對大鼠強迫游泳行為和曠場實驗的影響及其作用靶點
1. 4. 4 強迫游泳實驗
用來評價大鼠的絕望行為，是評價大鼠抑郁樣行為的重要指標。于正式實驗前24 h 將測試大鼠放入25 ℃水中，室溫25 ℃，大鼠懸浮四肢不能觸及桶底，15 min 后將大鼠取出、擦干后放回籠中; 次日在同樣的條件下進行強迫游泳5 min，記錄5 min 內(nèi)大鼠靜止不動時間( 大鼠僅有頭部露出水面，身體飄浮在水中，四肢可有微動但不掙扎) ，測試過程采用攝影機記錄。
2 討論
近年來，東莨菪堿的快速抗抑郁治效果已被多項臨床研究證實，東莨菪堿對大鼠強迫游泳行為和曠場實驗的影響及其作用靶點作用機制至今仍不清楚。作為M 受體的非選擇性拮抗劑，東莨菪堿與M1 ～ M5 5 種M受體亞型均可結(jié)合，如能找到介導東莨菪堿抗抑郁作用的具體靶點，將對于研發(fā)快速起效抗抑郁藥具有重要意義。
SuperFst強迫游泳實驗分析軟件
