1 材料和方法

1.1 動物 50 只健康C57BL/6J雄性小鼠，SPF級，10～12 周齡，體質量23～26 g。購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證：SCXK（滬）2012-0002。適應性飼養1周，溫度21～25 ℃，濕度50%～60%，光照12 h，期間正常飲水、攝食。

1.2 主要試劑和儀器 丁香精油，純度100%，原料產地為法國，購自廣東揭陽光合生物科技有限公司。精油，純度100%，原料產地為印度，購自廣東揭陽光合生物科技有限公司。TRNzol A+總RNA提取試劑、FastQuant RT Kit（With gDNase）購于北京天根生化有限公司；ssoFast熒光定量試劑購于美國Bio-Rad公司；小鼠血清5-HT ELISA試劑盒購于南京建成生物工程研究所。冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號：5424R）；普通梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號：T100TM Thermal Cycler）；醫用壓縮式霧化器（陜西民起電子科技有限公司，型號：MQB-13）；懸尾實驗觀察箱（上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XX203）；強迫游泳玻璃缸（上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XQ202）。

1.3動物建模、分組及干預**

1.3.1 小鼠抑郁模型建立：50 只C57BL/6J小鼠經體質量、懸尾測試實驗（tail suspension test，TST）、強迫游泳實驗（forced swim test，FST）及血清5-HT濃度測定初篩后選取各指標相近的45只小鼠。隨機從中挑取8 只小鼠作為正常組，剩下的37只小鼠采用慢性不可預知輕度應激模型（chronicunpredictable mild stress，CUMS）和孤養（單鼠單籠飼養）的建模方法[5]，連續應激28 d使其抑郁。應激包括24 h禁食禁水，冷水游泳（12 ℃，5 min），傾斜鼠籠（45°傾，8 h），搖鼠籠（1次/s，5 min），夾尾60 s，潮濕籠子8 h，熱水游泳（37 ℃，5 min），夜間照明12 h，夾尾90 s。以上9種刺激每天隨機給予1種，隔天刺激不重復，平均每種刺激3次，第18天不予刺激。造模成功的標準：經過28 d的刺激后，與正常和造模前小鼠相比，小鼠TST和FST不動時間百分比應顯著延長，體質量顯著降低或無明顯差異，血清5-HT濃度顯著下降。

1.3.2 分組和**方法：從抑郁癥造模成功的小鼠中篩選出32 只小鼠并隨機分為4 組。丁香組和莉組：分別采用丁香精油和莉精油進行霧化**，分別取50 μL精油和60 mL常溫蒸餾水混勻后，加入霧化機中。蒸餾水組：采用蒸餾水進行霧化**，取60 mL常溫蒸餾水加入霧化機。將霧化機的噴霧口接入小鼠飼養籠內，打開霧化機，讓小鼠持續吸入1 h，每天3 次，持續28 d，期間正常飲水、攝食。抑郁組：和正常組一樣，不予任何**措施，正常飼養。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 TST：將小鼠遠端尾部約1.5 cm固定后，頭向下懸掛，距離地面約35 cm。記錄時間總長為360 s，測定指標為懸掛時靜止不動的時間百分比，以此反映小鼠無助程度。

SuperTst懸尾實驗分析軟件：http://www.dzmykt.com/s02/product/2014/06/17/20368117.html

1.4.2 FST：將小鼠放入直徑為25 cm，高30 cm的透明玻璃水缸里，內注有15 cm高的水，水溫為21～25 ℃，總記錄時間為360 s，記錄的數據為120～360 s時間內，小鼠漂浮不動或輕微肢體活動的時間百分比，用來反映小鼠的無助程度。

SuperFst強迫游泳實驗分析軟件：http://www.dzmykt.com/s02/product/2014/06/11/20137130.html

1.4.3 體質量：分別于造模前、造模后、**后，記錄各組小鼠體質量情況，以反映造模后、**后小鼠生理情況。

1.4.4 血清5-HT測試：小鼠剪尾取血50 μL，室溫靜置2 h，使血液充分凝固，室溫3 000 r/min離心15 min，取20 μL上清液，加入等體積0.9%氯化鈉溶液稀釋至40 μL，按照ELISA說明書進行操作，*后用酶標儀測定OD值，根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的回歸方程。

1.4.5 OR 基因檢測：采用實時熒光定量PCR（RTqPCR）檢測小鼠OR 基因表達水平，先用TRIzol法提取小鼠嗅球區域組織總RNA。提取的RNA溶于DEPC處理水后經瓊脂糖凝膠電泳及紫外-可見分光光度計測其OD260/280值檢測RNA純度和濃度。cDNA模板的合成則按照反轉錄實驗手冊使用FastQuant cDNA**鏈合成試劑盒合成cDNA。反應體系包括10 μL反應體系一：2 μL 5×gDNA Buffer、1 μg RNA、RNase-Free ddH2O補足到10 μL；10 μL反應體系二：2 μL 10×Fast RT Buffer、1 μL RT Enzyme Mix、2 μL FQ-RT Primer Mix和5 μL RNase-Free ddH2O。

先將體系一于42 ℃孵育3 min后立即放置在冰上，然后將反應體系二全部加入反應體系一中；*后將混合反應體系42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，并4 ℃保存。合成的cDNA置于-20 ℃保存備用。以上所有樣品均設置3 個生物學重復。為了探索抑郁癥與嗅覺反應之間的關系，研究測定了**后相同周齡各組小鼠的13 個OR 基因（MOR11、MOR1、MOR124、MOR16、MOR378、MOR544、MOR19、MOR744、MOR63、MOR148、MOR9、MOR151和MOR15）表達水平。用GAPDH作為內參基因。用做RT-qPCR的所有基因的引物見表1。每個PCR反應體系為20 μL，包括10 μLSupermix，1 μL正向引物（10 μmol/L），1 μL反向引物（10 μmol/L），1 μL cDNA，7 μL**蒸餾水。采用的qPCR擴增程序為：預變性95 ℃ 3 min；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s和70 ℃ 10 s擴增40個循環。每個基因的相對表達水平采用Ct 值法的相對定量法計算。計算公式為2-ΔΔCt 來計算基因的相對表達量，其中：ΔΔCt =ΔCt 目的基因-ΔCt 正常組基因，ΔCt =Ct 目的基因-Ct 內參基因。

1.5 統計學處理方法 采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料用 ±s 表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時，方差齊性采用LSD法，方差不齊采用Games-Howell法，組內比較采用配對樣本t 檢驗。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量變化 造模前，各組小鼠體質量差異無統計學意義（P ＞0.05）。正常組小鼠在正常飼養28 d后，隨著年齡的增長，其體質量顯著增加（P ＜0.05）。其余4 組小鼠經過28 d造模成功后體質量與各自造模前差異無統計學意義（P ＞0.05），但是都顯著輕于相同周齡的正常組（P ＜0.05）。采用相應的芳香物質**28 d后，丁香組及莉組小鼠體質量與造模后比明顯增加（P ＜0.05），且與正常組差異無統計學意義（P ＞0.05）。蒸餾水組和抑郁組小鼠體質量與**前相比，差異無統計學意義（P ＞0.05），且顯著低于同周齡正常組（P ＜0.05）

2.2 懸尾不動時間百分比變化 造模前，各組小鼠懸尾不動時間百分比相近，差異無統計學意義（P ＞0.05）。造模后，丁香組、莉組、抑郁組和蒸餾水組小鼠懸尾不動時間百分比較造模前明顯上升（P ＜0.05），顯著高于正常組。正常組小鼠在正常飼養28 d后，其懸尾不動時間百分比差異無統計學意義（P ＞0.05）。采用相應的芳香物質**28 d后，丁香組小鼠懸尾不動時間百分比較造模后明顯下降（P ＜0.05），與正常組比差異無統計學意義（P ＞0.05）。莉組、蒸餾水組和抑郁組小鼠懸尾不動時間百分比較造模后差異無統計學意義（P ＞0.05），但仍有顯著高于正常組（P ＜0.05）。

2.3 強迫游泳不動時間百分比變化 造模前，各組小鼠強迫游泳不動時間百分比相近，差異無統計學意義（P ＞0.05）。正常組小鼠在正常飼養28 d后，其強迫游泳不動時間百分比差異無統計學意義（P ＞0.05）。造模后，丁香組、莉組、抑郁組和蒸餾水組小鼠強迫游泳不動時間百分比較造模前明顯上升，且顯著高于正常組（P ＜0.05）。采用相應的芳香物質**28 d后，丁香組小鼠強迫游泳不動時間百分比較**前顯著下降（P ＜0.05），且與正常組比差異無統計學意義（P ＞0.05）。mo莉組、蒸餾水組和抑郁組小鼠強迫游泳不動時間百分比較**前差異無統計學意義（P ＞0.05），但仍高于正常組（P ＜0.05）

2.4 小鼠血清5-HT濃度變化 造模前，各組小鼠血清5-HT濃度相近，差異無統計學意義（P ＞0.05）。正常組小鼠在正常飼養28 d后，其血清5-HT濃度差異無統計學意義（P ＞0.05）。造模后，丁香組、莉組、抑郁組和蒸餾水組小鼠血清5-HT濃度較造模前明顯下降，顯著低于正常組（P ＜0.05）。采用相應的芳香物質**28 d后，丁香組小鼠血清5-HT濃度較**前顯著提高（P ＜0.05），且與正常組差異無統計學意義（P ＞0.05）。莉組、蒸餾水組和抑郁組小鼠血清5-HT濃度較造模后差異無統計學意義（P＞0.05），但仍顯著低于正常組（P ＜0.05）

2.5 **后各組小鼠OR 基因表達水平比較 各組小鼠13個OR 基因檢測結果顯示，沒有經過任何**的抑郁組小鼠中除MOR11 外，其余OR 基因表達水平均顯著低于正常組（P ＜0.05）。丁香組、莉組和蒸餾水組小鼠OR 基因表達水平則根據基因和芳香化合物的不同，與正常組差異不一樣。丁香組小鼠中MOR11、MOR124、MOR16、MOR378、MOR15、MOR744、MOR1 和MOR63 的基因表達水平顯著高于正常組（P ＜0.05），MOR544、MOR19 和MOR151 的基因表達水平則與正常組差異無統計學意義（P ＞0.05）；與蒸餾水組比，丁香組小鼠除MOR151 和MOR1 的基因表達水平差異無統計學意義（P ＞0.05），其余OR 基因均顯著升高。莉組小鼠MOR744 和MOR1 基因表達水平顯著高于正常組，MOR11、MOR151、MOR63 與正常組差異無統計學意義（P ＞0.05），其余基因表達水平均顯著低于正常組（P ＜0.05）。莉組小鼠MOR11、MOR124、MOR19 和MOR378 基因表達水平與抑郁組比差異無統計學意義（P ＞0.05）。莉組與蒸餾水組小鼠MOR15、MOR544、MOR744、MOR151、MOR1 基因表達水平差異無統計學意義（P ＞0.05）。蒸餾水組小鼠MOR11、MOR744、MOR1、MOR63 基因表達水平顯著高于正常組，MOR124、MOR16、MOR378、MOR151與正常組比差異無統計學意義（P ＞0.05），MOR15、MOR19、MOR544 基因表達水平顯著低于正常組，但仍顯著性高于抑郁組（P ＜0.05）。見圖1-2。另外，在所有檢測的OR 基因中，只有MOR148 和MOR9 在經過丁香精油和莉精油霧化**后基因表達水平仍顯著低于正常組。

3 討論

抑郁癥目前的**手段有抗抑郁****、心理**、物理**、中醫**等方法，其中，抗抑郁**是主要的**手段，但也存在不足之處，如**反應較嚴重，易復發，服從性差，靶點單一等。中醫是我國醫療的特色，對抑郁癥的**也有獨特之處，例如針灸、藥膳、芳香療法等。相比針灸、藥膳，芳香物質療法更方便、舒適、易于接受。芳香療法可通過口服、腸道、吸入及局部皮膚等給藥途徑對機體產生作用，口服的方式吸收較快，但從**角度看，吸入和肌膚給藥較為**，而且方便控制劑量。芳香療法**抑郁癥需要嗅覺的參與，因此，OR 基因的表達水平高低對芳香**抑郁癥效果的評判具有重要的指標性意義。

嗅覺是動物感覺中*重要的本能感覺之一，由上千個基因超家族控制，特異性受體決定OR神經元所識別的氣味分子嗅覺信息除了傳導至大腦皮層產生嗅覺外，也可傳至邊緣系統，參與行為、記憶、情緒等活動，從而影響**及***功能。由于抑郁癥與嗅覺的關系密切，嗅球切除動物模型被廣泛運用于抗抑郁**的篩選。芳香氣味分子被吸入鼻腔，被鼻黏膜中的OR識別和結合，產生動作電位，嗅覺信號傳導至大腦皮層的嗅覺區，促進神經化學物質的釋放，然后經由大腦**神經發出指令，去調控和平衡植物神經系統，從而產生鎮定、放松、愉悅或興奮的效果。通過呼吸，植物的香味分子也可以進入肺部，在肺部進**體交換，再進入血液循環系統，達到相應的療效。因此芳香物質**法的效果與動物嗅覺之間具有很重要的關系。為了研究芳香化合物對抑郁癥的**效果，建立小鼠抑郁模型至關重要。建立動物抑郁模型的方法很多，如CUMS+孤養，行為絕望、社會應激、電誘導、利血平拮抗以及糖皮質**受體基因突變等，其中CUMS+孤養的小鼠抑郁癥建模方式不僅成功率高，模型可靠，而且能更好地模擬抑郁癥病征，可以用來探究病因、病理及測試**情況。這種建模方式30 年前由KATZ提出，迄今為止，已在許多研究中被成功運用。采用CUMS+孤養方式成功造模后，與正常小鼠相比，患有抑郁癥的小鼠多個生理指標會產生顯著性變化，如體質量下降、攝食量減少、敞箱實驗中水平運動及垂直運動得分下降，糖水偏愛百分比下降等，還有懸尾不動時間百分比及強迫游泳不動時間百分比顯著上升。

本研究采用CUMS+孤養方式造模后，與正常小鼠相比，患有抑郁癥的小鼠出現體質量下降，懸尾不動時間和強迫游泳時間延長，血清5-HT濃度降低等顯著性生理變化；與造模前相比除體質量無明顯變化外，其余指標均呈現相同趨勢的變化。這與以前的許多研究成果一致，表明抑郁癥模型造模成功。如楊春蕊采用CMUS+孤養的方法成功建立小鼠抑郁模型后，發現抑郁小鼠與造模前體質量差異不大，但與相同周齡正常小鼠相比，體質量有明顯下降；懸尾不動時間和強迫游泳不動時間也顯著延長。王艷梅也同樣通過CMUS+孤養的方式成功建立小鼠抑郁模型后，發現與造模前相比，懸尾不動時間和強迫游泳不動時間顯著增加，血清5-HT濃度明顯下降。另外，有研究表明，選擇6～8周齡小鼠成功造模后，抑郁小鼠體質量不僅與正常小鼠相比顯著下降，而且與造模前體質量比也有顯著下降。而本研究結果表明，小鼠抑郁后的體質量只顯著輕于相同周齡正常小鼠，與其造模前相比，卻無明顯變化。這可能與選取的小鼠周齡有關，我們選取的小鼠為成年期（8～12 周）小鼠。有研究表明，刺激年幼的動物，會增加對抑郁的易感性。因此，選擇成年期小鼠可以保證小鼠各項指標測試結果更加穩定.

芳香療法具有代謝快、高滲透性、不滯留、**反應小等優勢，容易透過血腦屏障，達到**效果，而且效果與西藥**相當。近年來，國內外學者對芳香物質**抑郁癥進行了大量的研究。早在2001年就有研究指出薰衣草香味可以緩解緊張情緒。2008 年，KIECOLT-GLASER等研究發現柑橘香味可以改善抑郁癥。2009 年，劉瑤等發現芳香療法與抗抑郁****療效相當，且芳香療法對消化道的**反應較抗抑郁**低。徐金勇等指出丁香吸入可緩解抑郁癥小鼠的抑郁行為。2010 年，牛利華等指出薰衣草吸入能有效改善抑郁癥小鼠的抑郁行為，并對其作用機制進行了初步探討，BAGATTA等研究發現佛手柑精油可減輕焦慮癥狀并能調節情緒。2013年，王艷梅研究表明，香草醛可改善小鼠抑郁行為。張乃舒等指出芳香療法可作為輔助療法用來緩解產后抑郁癥患者。魏永鴿等通過按摩、涂抹、吸入等方式使用精油能有效地改善亞健康狀態。2017年LEE等指出芳香療法可以緩解抑郁癥狀，提高睡眠質量，卻不影響生理參數如**因子等。國內*新臨床研究表明芳香精油經絡推拿對抑郁癥低動力癥狀有較好的臨床療效。

由此可見，利用芳香物質**抑郁癥一種行之有效的方法。本研究中抑郁癥小鼠在接受相應**后，通過測定小鼠的各項生理指標發現丁香精油霧化**法對抑郁癥具有確切療效，而莉精油霧化**法對抑郁癥療效較差。丁香精油霧化**可以緩解甚至**小鼠抑郁癥已在以前的研究中得到了驗證。有研究發現莉花香可以改善人的情緒，且飲用莉花茶可以起到抗抑郁的功效，這與我們的研究結果不一致，可能是由于采用的**方法不同或者是**的對象不同所導致。