臨床工作中經(jīng)常遇到嬰幼兒患者因病情需要接受多次手術(shù)麻醉，如燒創(chuàng)傷、整形患兒7~10d進(jìn)行一次切痂植皮，或喉乳狀瘤患兒約20d進(jìn)行一次近6h全身麻醉下的手術(shù)，對(duì)于此類患兒在大腦發(fā)育期經(jīng)歷多次(≥3次)異氟烷吸入麻醉對(duì)其隨后的認(rèn)知功能是否有影響目前尚不明確。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，多次間隔時(shí)間較短的異氟烷處理對(duì)隨后的空間認(rèn)知功能(八臂迷宮、水迷宮等)有一定影響，但對(duì)于非空間記憶如物體識(shí)別能力是否有影響，以及如何減弱或避免該影響尚未見報(bào)道。目前已知規(guī)律運(yùn)動(dòng)對(duì)不同年齡段的認(rèn)知均具有促進(jìn)作用，尤其在幼年時(shí)期的作用更為顯著，因此，本研究應(yīng)用物體識(shí)別行為學(xué)實(shí)驗(yàn)(object recognitiontask，ORT)探索了發(fā)育期多次異氟烷處理后進(jìn)行規(guī)律運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠成年后非空間認(rèn)知功能中物體識(shí)別能力的影響及其性別差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組　生后7d(P7)的SD大鼠110只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)：11401300035796。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對(duì)照組(Naive)、運(yùn)動(dòng)組(Naive+PE)、異氟烷組(Iso)和異氟烷運(yùn)動(dòng)組(Iso+PE)。實(shí)驗(yàn)前測(cè)量各組大鼠體重，P7、P9和P11時(shí)，Naive及Naive+PE組大鼠在上午8:00放置于透明有機(jī)玻璃麻醉誘導(dǎo)箱中自由呼吸空氣2h；而Iso及Iso+PE組大鼠則暴露于異氟烷中2h。大鼠P21時(shí)，Naive+PE和Iso+PE組大鼠開始規(guī)律運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練6周，隨即進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及**次物體識(shí)別測(cè)試，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后4周，再次進(jìn)行物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)后的近期(P67)及遠(yuǎn)期(P95)效果。新生大鼠和母鼠單籠飼養(yǎng)，出生3周后按雌雄分籠。實(shí)驗(yàn)室溫度25±1℃，相對(duì)濕度45%~55%，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)用75%乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)裝置及物體。實(shí)驗(yàn)方案通過醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物處置過程中所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 異氟烷處理　采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉機(jī)(美國MATRX公司)以3%異氟烷(山東魯南貝特，生產(chǎn)批號(hào)64140302)誘導(dǎo)，1.5%異氟烷與30%氧氣混合吸入維持2h。通過檢查幼鼠呼吸頻率及每15min夾尾確保其存活，采用ALC-HTP動(dòng)物恒溫系統(tǒng)(上海奧爾科特)維持體溫在36.5±0.5℃，開啟CO2吸附器吸收廢氣。

1. 3 大鼠運(yùn)動(dòng)方案　P21 時(shí)兩組運(yùn)動(dòng)大鼠每天1 4 : 0 0 ~ 1 7 : 0 0 訓(xùn)練， 應(yīng)用XR -PT-10A小動(dòng)物跑臺(tái)( 上海欣軟信息科技有限公司) ， 跑臺(tái)是相互間隔的6 條跑道， 每條跑道有效空間為600mm×95mm×115mm，跑臺(tái)0°傾角不變，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度逐漸加大，幼鼠在跑臺(tái)上先適應(yīng)10min，從4m/min開始，每周增加2m/min至14m/min，30min/d，每周5d，持續(xù)6周；運(yùn)動(dòng)后統(tǒng)一送回動(dòng)物房飼養(yǎng)，剔除因受傷等未完成6周訓(xùn)練的大鼠。

1.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 用于評(píng)估動(dòng)物一般運(yùn)動(dòng)能力及探索行為。曠場(chǎng)箱高40cm，長寬均為100cm，動(dòng)物在安靜黑暗實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)30min，將每只動(dòng)物放入箱內(nèi)中心位置，并進(jìn)行錄像和計(jì)時(shí)，任其自由探索5min，分析動(dòng)物在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)及周圍區(qū)所待時(shí)間。

型號(hào)：XR-XZ301

1.5 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用曠場(chǎng)測(cè)試箱，利用嚙齒類動(dòng)物喜歡接觸和探索新奇事物的天性檢測(cè)動(dòng)物非空間記憶能力。實(shí)驗(yàn)分為三步。① 適應(yīng)階段( hab i t u a t i o nsession)：將大鼠依次放入沒有任何物體的測(cè)試箱中，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，連續(xù)3d，共6次。②熟悉階段(sample session)：在距側(cè)壁10cm處放入兩個(gè)相同物體——黃色玻璃瓶(F1和F2，高11cm×寬4.8cm)，將大鼠以背對(duì)物體方向放入，自由探索5min后將大鼠取出，記錄大鼠物體探索時(shí)間。③測(cè)試階段(test session)：24h后進(jìn)行測(cè)試，將兩個(gè)相同物體中F2替換成另一物體N，即熟悉物體(F1)和新奇物體(N)，記錄大鼠5min對(duì)兩物體的探索時(shí)間。F1和N的位置隨機(jī)置換，以避免位置偏倚。探索活動(dòng)定義為：大鼠鼻子在≤2cm范圍內(nèi)直指向物體或直接接觸物體時(shí)的行為，大鼠轉(zhuǎn)頭或坐在物體上時(shí)不被認(rèn)為是對(duì)物體的探索。P67時(shí)**次測(cè)試時(shí)新奇物體N為紅色塑料瓶(高11cm×寬7cm)；P95時(shí)**次測(cè)試新奇物體N為金屬鑷筒(高12cm×寬7cm)。

檢測(cè)指標(biāo)： 采用動(dòng)物行為分析系統(tǒng)( SuperMaze動(dòng)物行為分析軟件) 對(duì)曠場(chǎng)及物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中各物體的探索時(shí)間進(jìn)行分析。物體識(shí)別辨別指數(shù)用DR(discrimination ratio)表示。DR=(N–)/(N+F)。

“N”為大鼠對(duì)新奇物體的探索時(shí)間，“F”為大鼠對(duì)熟悉物體的探索時(shí)間。DR范圍為[–,1]，

“–”提示大鼠完全偏向于熟悉物體，而“1”則完全偏向于新奇物體。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況　隨日齡增長，各組大鼠體重增加，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。異氟烷處理后，各組內(nèi)、組間雌/雄幼鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。飼養(yǎng)及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練過程中剔除受傷或拒絕運(yùn)動(dòng)大鼠18只(雄性11只，雌性7只)，*終Naive組雌鼠15只、雄鼠11只，Naive+PE組雌鼠13只、雄鼠10只，Iso組雌鼠10只、雄鼠12只，Iso+PE組雌鼠11只、雄鼠10只。

2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果　與Naive組相比，各組大鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)及周圍區(qū)探索時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)，提示發(fā)育期多次異氟烷處理及是否規(guī)律運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠成年后焦慮、探索等自主行為沒有明顯影響。

2.3 發(fā)育期多次異氟烷處理對(duì)大鼠成年后物體識(shí)能力的影響　與非運(yùn)動(dòng)組相比，無論是否經(jīng)過異氟烷處理，運(yùn)動(dòng)組(Naive+PE)雄鼠DR均明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(與Naive組及Iso組比較，P67時(shí)P=0.050、P=0.017，P95時(shí)P=0.037、P=0.019；圖2)；而運(yùn)動(dòng)組雌鼠與Naive組相比，P67時(shí)DR無明顯差異(P=0.252)；與Iso組相比，P67時(shí)運(yùn)動(dòng)雌鼠DR顯著下降(P=0.036)，到P95時(shí)，與Naive組相比，運(yùn)動(dòng)組雌鼠DR明顯增強(qiáng)(P=0.004)，與Iso組相比，運(yùn)動(dòng)組雌鼠DR也有增強(qiáng)趨勢(shì)(P=0.095)。此外，在P95時(shí)，Naive+PE組和Iso組雄鼠的DR及Naive+PE組和Iso+PE組雌鼠的DR均較P67時(shí)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032，P=0.022，P=0.007，P=0.002)。結(jié)果提示運(yùn)動(dòng)對(duì)雄性大鼠的物體識(shí)別能力有明顯促進(jìn)作用，而對(duì)雌性大鼠的促進(jìn)作用主要表1 運(yùn)動(dòng)對(duì)異氟烷處理大鼠成年后曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響別能力的影響　在P67和P95時(shí)各組大鼠探索時(shí)間比較，組內(nèi)即組建差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。物體識(shí)別測(cè)試發(fā)現(xiàn)：與Naive組相比，Iso組雌性大鼠在P67時(shí)的辨別指數(shù)DR明顯增強(qiáng)(P=0.034)，但到P95時(shí)僅出現(xiàn)降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.173)；而Iso組雄性大鼠在P67和P95時(shí)DR均有增強(qiáng)趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.341，P=0.052，圖1)。提示發(fā)育期異氟烷處理對(duì)于不同性別大鼠成年后物體識(shí)別能力的影響存在性別差異，且均無明顯的功能損害。

2.4 運(yùn)動(dòng)對(duì)多次異氟烷處理大鼠成年后物體識(shí)別能力

2.5 運(yùn)動(dòng)對(duì)異氟烷處理大鼠成年后物體識(shí)別能力影響的性別差異　與雄鼠相比，P67時(shí)非運(yùn)動(dòng)組雌鼠DR明顯較強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Naive組，P=0.022；Iso組，P=0.011)；到P95時(shí)，僅沒有經(jīng)過異氟烷處理的兩組雌鼠DR高于雄鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Naive組，P=0.008；Naive+PE組，P=0.017，圖3)。提示雌鼠的物體識(shí)別能力明顯優(yōu)于雄性，但運(yùn)動(dòng)能夠明顯促進(jìn)雄鼠的物體識(shí)別能力的提升。

3 討　　論

臨床及基礎(chǔ)研究顯示， 發(fā)育期接受多次麻醉和手術(shù)是導(dǎo)致學(xué)習(xí)障礙的獨(dú)立影響因素，其中麻醉物在大腦發(fā)育期產(chǎn)生的神經(jīng)發(fā)育毒性(anesthesia-induced developmental neurotoxicity，AIDN)對(duì)成年后認(rèn)知功能的影響也一直備受關(guān)注，但目前尚未有明確的結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)，生后發(fā)育期多次異氟烷處理對(duì)大鼠成年后非空間認(rèn)知功能中的物體識(shí)別能力無明顯損害，并證實(shí)運(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)大鼠成年后的物體識(shí)別能力，且具有明顯的性別差異，雄性大鼠的運(yùn)動(dòng)獲益較為明顯，而雌鼠的獲益主要體現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后的遠(yuǎn)期效果上。

物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是測(cè)試大鼠物體識(shí)別能力的常用方法，*早由Ennaceur等報(bào)道，利用嚙齒類動(dòng)物喜歡探索新事物的自發(fā)行為進(jìn)行評(píng)價(jià)。應(yīng)用該方法時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無須食物誘導(dǎo)，沒有強(qiáng)烈的厭煩因素(如水迷宮中等游泳壓力等)，避免了情緒波動(dòng)的影響，較為客觀準(zhǔn)確。盡管發(fā)育期異氟烷處理對(duì)大鼠成年后在八臂迷宮及水迷宮的空間記憶能力具有一定影響，但在本研究中對(duì)大鼠物體識(shí)別能力未產(chǎn)生明顯損害，甚至在P67時(shí)雌鼠及雄鼠的物體識(shí)別能力表現(xiàn)出增強(qiáng)趨勢(shì)，但P95時(shí)測(cè)試發(fā)現(xiàn)對(duì)雌鼠對(duì)識(shí)別能力存在一定的損害趨勢(shì)。可能的原因?yàn)槲肼槲锟赏ㄟ^降低腦代謝、減少氧耗、增加氧供而抑制神經(jīng)元受損，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用，如有研究顯示麻醉**藥丙泊酚對(duì)腦損傷具有一定的保護(hù)作用。人類及動(dòng)物研究均證實(shí)，雌性的整體認(rèn)知發(fā)育明顯早于雄性，發(fā)育期異氟烷處理對(duì)雌性認(rèn)知功能對(duì)損害可能會(huì)延續(xù)到遠(yuǎn)期，而雄性仍在發(fā)育階段，給予一定程度的刺激可能促進(jìn)大腦神經(jīng)重塑及修復(fù)等機(jī)制，反而促進(jìn)其未來認(rèn)知的發(fā)育，但其具體作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。運(yùn)動(dòng)作為環(huán)境刺激的一部分，對(duì)大腦認(rèn)知功能的影響因運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與時(shí)長不同而不同，如低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)明顯促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖，增高神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平，刺激樹突分支形成、突觸發(fā)生等，尤其在大腦發(fā)育階段作用更為明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是否經(jīng)歷發(fā)育期異氟烷處理，運(yùn)動(dòng)均可明顯促進(jìn)雄性大鼠但物體識(shí)別能力。該結(jié)果與Hopkins等的研究一致，他們發(fā)現(xiàn)雄性大鼠經(jīng)過4周自愿運(yùn)動(dòng)后物體識(shí)別記憶能力明顯提高，且大腦嗅周皮質(zhì)(PER)內(nèi)BDNF水平升高。但對(duì)于雌鼠，在運(yùn)動(dòng)后1周的測(cè)試中，運(yùn)動(dòng)組物體識(shí)別能力未見明顯提高，直到運(yùn)動(dòng)結(jié)束后4周，運(yùn)動(dòng)促進(jìn)物體識(shí)別能力提高等效果才有所顯現(xiàn)。以往研究也證實(shí)，發(fā)育期接受運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響較成年大鼠能夠持續(xù)更長時(shí)間。上述結(jié)果提示發(fā)育期進(jìn)行運(yùn)動(dòng)鍛煉能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生更為持久的作用。既往的基礎(chǔ)研究多選用雄性動(dòng)物，以避免雌孕**水平波動(dòng)而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但認(rèn)知水平的發(fā)展是具有性別差異的，從八臂迷宮測(cè)試中可以發(fā)現(xiàn)，雌鼠認(rèn)知行為表現(xiàn)明顯強(qiáng)于雄鼠。雌孕**增強(qiáng)神經(jīng)可塑性，提高大鼠對(duì)物體識(shí)別能力。相比空間記憶，雌**對(duì)物體識(shí)別記憶的影響更為明顯。本研究也證實(shí)，P67時(shí)除Iso+PE組外，其余各組雌鼠的表現(xiàn)明顯優(yōu)于雄性；在P95時(shí)，非異氟烷處理的兩組雌鼠物體識(shí)別能力依然強(qiáng)于雄鼠。上述研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于探索雌孕****年齡相關(guān)性記憶減退或其他認(rèn)知障礙性**具有重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，發(fā)育期多次異氟烷處理及運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠成年后物體識(shí)別能力對(duì)影響均具有性別差異，雌鼠的物體識(shí)別能力明顯優(yōu)于雄性，但運(yùn)動(dòng)對(duì)物體識(shí)別能力的促進(jìn)作用在雄鼠更為明顯，雌鼠僅體現(xiàn)為遠(yuǎn)期效應(yīng)。本研究對(duì)于探討臨床經(jīng)歷多次手術(shù)麻醉的患兒成年后對(duì)物體識(shí)別能力提供了可參考的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，提示運(yùn)動(dòng)對(duì)于此類患兒具有重要意義，盡管存在性別差異，但運(yùn)動(dòng)均可促進(jìn)遠(yuǎn)期物體識(shí)別能力的增強(qiáng)，減輕可能存在的AIDN所引起的認(rèn)知損害。但對(duì)于雌孕**是否具有確切的促進(jìn)認(rèn)知的作用，仍需進(jìn)一步研究探索。