摘要: 曠場實驗高架十字迷宮對焦慮大鼠血清水平的影響

目的:研究曠場實驗高架十字迷宮對焦慮大鼠血清水平的影響白香丹膠囊對焦慮模型大鼠血清及腦區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平的影響及焦慮癥發(fā)病相關(guān)**機制。

方法:采用足底電擊法(Foot Shock-FS)誘發(fā)大鼠焦慮樣行為，以曠場實驗和高架十字迷宮實驗對其進行行為學(xué)檢測、ELISA檢測大鼠血清BDNF含量、Western  blot檢測大鼠腦區(qū)BDNF蛋白的表達。

結(jié)果:與空白組比較，模型組大鼠曠場實驗總路程增加(P<0.01)，高架十字迷宮實驗進入開放臂次數(shù)百分?jǐn)?shù)(OE %)和開放臂停留時間百分?jǐn)?shù)(OT%)均降低(P < 0. 0l) , ELISA實驗所測大鼠血清BDNF水平降低(P < 0. 0l ) , Western blot檢測大鼠各腦區(qū)(左海馬、右海馬、額葉、下丘腦)BDNF蛋白表達水平降低(P<0.01);與模型組比較，白香丹組和地西洋組大鼠運動總路程均降低(P < 0. 05) ,OE%和OT%均升高(P < 0. 05) , BDNF水平均升高(P < 0. 05)，各腦區(qū)BDNF蛋白表達水均升高(P < 0. 05或P<0.01).

結(jié)論:中藥白香丹膠囊對足底電擊法誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為具有明顯的拮抗作用，BDNF是其作用靶點之一。

      焦慮是精神障礙五大癥狀群之一，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，越來越受到人們的重視。目前，焦慮癥的病因和發(fā)病機制不明確，神經(jīng)發(fā)生假說是當(dāng)今研究的一個熱點。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurophic; factor. BDNF)是腦內(nèi)含量*多的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)元的生長發(fā)育、分化、存活、損傷后修復(fù)等起重要作用，與包括焦慮障礙在內(nèi)的多種神經(jīng)精神性**發(fā)生有關(guān)。己有的Meta分析研究表明，焦慮障礙患者個體BDNF水平低于正常對照，但整體水平不一致，取決于檢測的BDNF來源和患者焦慮類型。

      中醫(yī)藥在焦慮癥的**中優(yōu)勢顯著，但具體靶點和作用機制尚未完全明確。白香丹膠囊由白芍、香附和丹皮有效組分組成，臨床**焦慮效果顯著。本研究采用足底電擊法誘發(fā)大鼠焦慮樣行為，以國際通用的曠場實驗和高架十字迷宮實驗對各組大鼠行為學(xué)進行評價，采用ELISA法檢測大鼠血清BDNF含量、Western blot檢測大鼠腦區(qū)BDNF蛋白的表達，以探索焦慮癥的相關(guān)病因，明確白香丹膠囊的相應(yīng)療效機制。

1材料

1. 1動物 健康雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量120- 150g，購自山東魯抗實驗動物中心[許可證號:SCXK魯)20080002。動物于實驗前7 d進入實驗室以適應(yīng)環(huán)境。室溫20度，濕度50%一70 %。大鼠均飼養(yǎng)于晝夜顛倒環(huán)境，每日20:00開燈，8:00關(guān)燈。

1.2**及試劑 白香丹膠囊(BXD)，山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點實驗室自制，批號040201;地西洋片( DZP)，規(guī)格:片劑，每片2. 5 mg，**藥。國藥準(zhǔn)宇H37023039，山東省平原制藥廠出品。大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNFELISA試劑盒購自濟南凱萊生物技術(shù)有限公司。BDNF  ( N一20)(兔抗人，*sc一546)一抗，p一actin(小鼠抗人，sc一81178)一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔)均購自關(guān)國Santa-Cruz公司;預(yù)染蛋白Marker ( PICPI26651)購自關(guān)國Thereto FisherScientific公司;ECL試劑盒(Z LI一9032)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;其他化學(xué)試劑主要購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1. 3主要儀器 大鼠曠場實驗箱、大鼠高架十字迷宮(EPM) ，supermaze動物行為分析系統(tǒng)，均購自上海欣軟信息科技有限公司;ST一A數(shù)宇脈沖生物刺激儀(由濟南空軍后勤裝配總廠、山東中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合研制);酶標(biāo)儀(芬蘭 Labsystems Multiskan MS，型號352型);洗板機(芬蘭Thereto Labsystems，型號AC8);轉(zhuǎn)印儀(Mini一protean3 165一3323.美國B io-Rad公司);微量高速離心機(國產(chǎn)，型號TG16W);

2方法

2. 1動物分組、造模及給藥大鼠經(jīng)1周適應(yīng)期后進行曠場實驗，選取曠場實驗得分相近的40只大鼠進行實驗，并隨機分為4組，每組10只，即空白組、模型組、白香丹膠囊給藥組(BXD組)、地西洋給藥組(DZP組)。①空白組:不給予仟何刺激，正常飼養(yǎng)，每天給予無菌飲用水。②模型組:利用ST一A數(shù)字脈沖生物刺激儀，采用足底電擊法誘發(fā)大鼠焦慮樣行為，具體做法為:將擬造模大鼠置入可調(diào)式激怒、噪音、脈沖電刺激籠內(nèi)，造模條件設(shè)定為白天2檔(間隔時間為5min)，夜間3檔(間隔時間為10 min)，中等強度電流0. 5 mA，電壓2700一3300 v，脈寬0. 3s，刺激時間共12 d;造模的同時給予無菌飲用水。③ BXD組:按②造模，同時給予白香丹200 mg .kg -1 " d -1.灌胃給藥12d  .DZP組:按②造模，同時給予地西洋1mg .kg -1.d-1 .灌胃給藥12 d。造模完成后即采用曠場實驗和高架十字迷宮實驗對其行為學(xué)表現(xiàn)進行評價。

2. 2行為學(xué)測試實驗室內(nèi)只開紅光燈，光線昏暗(以1. 5 m距離處能區(qū)分大鼠細微活動的*低亮度為宜)，保持恒亮，室溫21℃，安靜。測試箱放置于實驗室的一角。

曠場實驗:采用大鼠曠場實驗對大鼠進行運動能力評價，操作者握住大鼠尾根部1 /3處，小心放入曠場中央，用攝像系統(tǒng)及supermaze動物行為分析系統(tǒng)記錄大鼠3 min的行為變化，選取曠場運動總路徑作為大鼠運動能力評價指標(biāo)。

EPM實驗:采用大鼠高架十字迷宮、攝像系統(tǒng)及supermaze動物行為分析系統(tǒng)記錄大鼠5  min的行為變化進行大鼠焦慮狀態(tài)評價，主要進行OE. OT. CE. CT四個指標(biāo)的測定，并計算開放臂進入次數(shù)比例[COE%O，即OE/ (OE + CE)  x 100%」和開放臂停留時間比例COT%O，即OT /(OT+CT)  x 100%]。

2. 3ELISA實驗和Western blot檢測行為學(xué)測試結(jié)束后對各組大鼠斷頭取血，分離血清，用ELISA試劑盒檢測血清BDNF水平。BDNF試劑盒(生產(chǎn)批號E- 30664)，購自廈門慧嘉生物科技有限公司。實驗操作均按照試劑盒說明進行，*后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠血清BDNF濃度。

行為學(xué)測試結(jié)束后大鼠迅速斷頭，取血，迅速剝離左海馬(z）、右海馬(Y)、額葉(E)、下丘腦(X)，提取總蛋白，Bradford方法蛋白定量。SDS - PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。加入一抗(BDNF  1 : 500 ; Tubulin1: 1000 ) 4℃過夜或室溫搖床孵育1 h，二抗(1:5000)室溫搖床孵育1 h. TBST洗滌3次。ELL發(fā)光液顯色，暗室曝光檢測，用凝膠成像分析儀在可見光下對顯色膜進行掃描和圖像分析以BDNF /Tuhulin為BDNF蛋白的相對光密度值。

2. 4統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17. 0統(tǒng)計軟件分析，采用GraphPad  Prism 5. 0軟件進行統(tǒng)計作圖。多個樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，顯著性水平為P<0.05.

3結(jié)果

3. 1BXD對大鼠曠場運動總路徑的影響曠場實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠曠場運動總路徑高于空白組(p<0.01)，采用足底電擊法成功誘發(fā)了大鼠焦慮樣行為。BXD組和DZP組大鼠的曠場運動總路徑低于模型組(P<0.01)，提示中藥白香丹膠囊、西藥地西洋均干預(yù)有效(見圖1) 。

3. 2   BXD對大鼠EPM實驗中OE% . OT%的影響EPM實驗結(jié)果表明，模型組大鼠的OE /%和OT /%均低于空白組大鼠(P<0.01)，采用足底電擊法成功誘發(fā)了大鼠焦慮樣行為;;BXD組和DZP組的OE /%和OT/%均高于模型組(P <0.01)，提示中藥BXD和西藥DZP均能有效降低大鼠的焦慮樣行為，見圖2a和圖2b。

3. 3   BXD對大鼠敘清中BDNF含量的影響ELISA實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠的血清BDNF含量低于空白組大鼠(P<0.01);BXD組和DZP組大鼠血清的BDNF含量高于模型組大鼠(P<0.01)，提示中藥BXD和西藥DZP均能有效提高BDNF含量水平，結(jié)果見圖3。

3. 4   Western blot檢測大鼠各腦區(qū)BDNF蛋白表達水平模型組大鼠各個腦區(qū)(左海馬、右海馬、額葉、下丘腦)BDNF蛋白表達水平均低于空白組大鼠(P<0. 01) ; BXD組和DZP組大鼠的BDNF蛋白表達水平均高于模型組大鼠(P <0.05或P <0.01)，結(jié)果見圖4a.4b和表1.

4討論

      本研究前期曾采用不確定性空瓶刺激法建立焦慮大鼠模型，雖然成功造模，但由于該方法對大鼠飲水時間、次數(shù)的限制，后期采血比較困難等因素，對實驗影響比較大，不利于深入研究。焦慮障礙本身存在著心身兩方而的異常。足底電擊法是一種基于條件反射的焦慮動物模型造模方法，既包含心理應(yīng)激，也包含物理應(yīng)激的成分，可有效模擬人類的焦慮反應(yīng)，預(yù)測**抗焦慮活性。

    曠場實驗和EPM實驗是經(jīng)典的檢測焦慮反應(yīng)的方法。曠場實驗中運動總路程可反映大鼠的興奮性,EPM實驗原理是利用動物對新異環(huán)境的探究特和對高懸敞開臂的恐懼心理，形成動物的矛盾沖突來考察大鼠的焦慮狀態(tài)，以OE%和OT%反映動物的焦慮狀態(tài)。本研究焦慮模型組大鼠曠場實驗運動總路徑較空白組大鼠明顯升高;模型組大鼠EPM測試中OE%和OT%較空白組大鼠明顯降低，表明采用足底電擊法成功誘發(fā)了大鼠焦慮樣行為，造模成功。DZP組和BXD組大鼠運動總路徑較模型組大鼠均降低、OE%和OT%較模型組大鼠均提高，說明中藥白香丹膠囊和西藥地西洋均可使模型組大鼠的焦慮樣行為得到緩解，而且BXD抗焦慮作用效果要優(yōu)于DZP.

    BDNF于腦內(nèi)合成，是由119個氨基酸殘基組成的分泌型成熟多膚，分子量為13. 15 kD，可透過血腦屏I漳。己有的臨床實驗發(fā)現(xiàn)，廣泛性焦慮I漳礙患者的血清BDNF含量較正常人明顯降低，帕羅西汀片**后顯著性升高回。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清BDNF水平顯著低于空白組大鼠，與己有的臨床實驗報道一致，從另一方而證實模型制備成功;模型組大鼠各個腦區(qū)BDNF蛋白表達較空白組亦顯著性降低，與血清檢測結(jié)果一致，表明血清BDNF含量可反映腦內(nèi)BDNF蛋白水平;DZP組和BXD組大鼠血清和各腦區(qū)BDNF水平較模型組升高，和空白組無明顯差異，提示白香丹膠囊療效與地西洋片相似，可有效改善BDNF水平。由此可見，BDNF是白香丹膠囊的作用靶點之

      白香丹膠囊由白芍、香附和丹皮的有效組分構(gòu)成。己有的研究表明，白芍有效組分包括芍藥有、牡丹酚、芍藥花有等化學(xué)成分，主要有**、鎮(zhèn)痛、**等藥理作用[U al;香附有效組分為揮發(fā)油，對于**神經(jīng)系統(tǒng)的作用主要為**、鎮(zhèn)痛[Cisl;丹皮主要有效組分為丹皮酚，有顯著的抗焦慮性行為作用[C ml。本實驗證實白香丹膠囊具有顯著的抗焦慮作用，根據(jù)己有的文獻，可推測丹皮有效組分發(fā)揮重要抗焦慮作用，白芍和香附是否具有抗焦慮作用功效，或與丹皮發(fā)揮協(xié)同作用需要進一步的實驗予以證實。動物實驗也顯示，以白芍為重要組分的四逆散和逍遙散可顯著改善慢性應(yīng)激模型大鼠海馬BDNF表達降低[Cn-isl，白芍與熟地黃配伍亦可升高大鼠腦組織中BDNF水平09}，含有白芍、香附、丹皮的疏肝解郁飲可使抑郁模型大鼠血清BDNF水平明顯回升Czol;細胞研究則表明丹皮酚可增加海馬神經(jīng)元BDNF的表達[。因此，可推斷，白香丹膠囊可有效升高焦慮大鼠血清及腦內(nèi)BDNF水平可能是白芍、香附和丹皮三者有效組分共同作用的結(jié)果，具體哪種組分起主要作用需要深入探索。

      綜上，曠場實驗高架十字迷宮對焦慮大鼠血清水平的影響，BDNF是其作用靶點之一。白香丹膠囊的哪些有效成分如何作用于BDNF，需要進一步探索。