大小鼠條件恐懼實驗方法

（Fear Conditions test）

一.實驗原理

條件性恐懼實驗系統(tǒng)（場景恐懼系統(tǒng)）用于小型嚙齒類動物（大、小鼠）環(huán)境相關條件性恐懼實驗研究。嚙齒類動物在恐懼時會表現(xiàn)出特有的不動狀態(tài)（Freezing），動物在這種情況下傾向于保持靜止不動的防御姿勢。抗抑郁藥和抗**興奮藥可以明顯縮短不動狀態(tài)持續(xù)的時間。

實驗過程中，實驗對象被給與一個聲音信號（條件刺激），隨后給予電擊（非條件）刺激。該訓練稱為條件性訓練，訓練結束后實驗動物進行聲音信號或環(huán)境聯(lián)系性實驗。一般情況下嚙齒類動物對相應的環(huán)境和不同環(huán)境下同樣的聲音信號都會做出明顯的條件性恐懼反應，如僵直靜止不動。這種測試可以在訓練結束后立刻或幾天后進行可以提供在條件信號影響下短期和長期記憶的信息。

二.實驗裝置

恐懼箱材質(zhì)采用無味的ABS塑料材質(zhì)或者醫(yī)用有機板，顏色為黑色或者灰色。上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)的恐懼系統(tǒng)包括一個30cm*30cm，底部可通電的實驗箱、一個直徑為5cm/10cm 的平臺、隔音箱（內(nèi)附吸音棉）以及SuperFcs條件恐懼視頻分析軟件，通常平臺高度與直徑一樣，尺寸可定制。實驗箱上方安裝錄像監(jiān)控器（視頻盒），以錄制動物在實驗箱中的活動情況，以供日后分析使用。

三.實驗方法

A方案

1. 在實驗前一個星期，每天撫摸實驗動物1-5min，連續(xù)7天，（這個時間段需要實驗員根據(jù)實際情況來定制）借以消除實驗動物對實驗者的恐懼。

2. 訓練期：訓練時將動物放入恐懼箱內(nèi)適應3min，然后給予聲光刺激（持續(xù)30s，70db，3000Hz）和底部**通交流電（持續(xù)2s，0.5mA），結束后停留30s，將動物再放回飼養(yǎng)籠。

3. 測試期：將動物重新放回實驗箱，不給予任何刺激，記錄動物5min內(nèi)僵直反應時間（除呼吸運動外無其他任何行為活動的狀態(tài)）。測試后2h，進行改變環(huán)境（實驗箱放入分隔板、側(cè)壁換成斑馬紋板或者壁上貼上其他形狀物體）的條件性（無聲音180s；聲音180s，70db，3000Hz）恐懼測試。每次實驗結束后，用酒精檫拭場地，避免氣味干擾。

B方案

將大鼠放在動物飼養(yǎng)室內(nèi)適應一周。飼養(yǎng)室內(nèi)溫度為24±0.5℃，濕度為60%，光：暗周期為12h：12h（光照時間為8：00-20：00），隨機分籠單獨飼養(yǎng)，自由進食、飲水。

（1）條件性恐懼的建立：將大鼠分別放入斯金納箱（箱子底部為銅條柵欄，可通電）內(nèi),適應2分鐘后再給予單一頻率聲音信號(4.5KHZ,60dB,30S，該聲音由美國Adobe公司的Adobe Audition2.0軟件制作)適應4次（兩次聲音間隔1-4分鐘）,然后再給予6次以聲音信號為提示的不可逃避足底電擊(1mA,5s)，聲音與電擊同時結束，兩次聲音間隔為1-4分鐘，共28分鐘。動物在被電擊時發(fā)生驚叫、驚跳、逃避等,聽到聲音提示時出現(xiàn)慌張、逃避或者僵立行為（除呼吸外無其他運動行為），這樣建成恐懼動物模型（以下簡稱建模）。實驗結束后讓動物在斯金納箱內(nèi)繼續(xù)停留2分鐘后放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)。每次實驗結束后用90%酒精擦拭箱底，用濕布擦拭箱壁，以避免殘留氣味對后續(xù)實驗大鼠的影響。

（2）恐懼消退訓練：24h后將已經(jīng)建立條件性恐懼的動物再次放入斯金納箱內(nèi)，僅給予聲音信號16次，兩次聲音間隔為1-2分鐘，共24分鐘。恐懼對照組在對應的時間點放進斯金納箱內(nèi)24分鐘，不進行消退訓練（不給聲音刺激）。 (3)條件性恐懼消退保持測試：恐懼對照組和恐懼消退組（注：此時大鼠分為兩組：恐懼消退組和對照組）分別在恐懼消退訓練后的第1、3、7天將大鼠放在訓練箱內(nèi)，給予5次聲音信號，時間間隔為0.5s，記錄3分鐘內(nèi)的不僵立時間，計算3分鐘內(nèi)不僵立時間百分比，作為消退保持成績。百分比越高，表明消退保持成績越好。

<備注>：實驗方法摘錄相關文獻，僅供參考使用。

四.實驗數(shù)據(jù)

主要應用的實驗數(shù)據(jù)：                        

1.Freezing次數(shù)，動物在實驗箱中前后一共出現(xiàn)的僵直次數(shù)                         

2.Freezing時間，實驗開始后動物一共出現(xiàn)僵直行為的總時間

這2個指標作為評價動物恐懼記憶的重要指標，通常這兩個指標高度相關。

五.注意事項

1. 實驗前一周每天撫摸大鼠可以明顯減少大鼠對實驗者的恐懼感以及無關刺激對實驗箱中動物的影響。

2. 盡管還沒有證據(jù)證實在**中不同時間對于實驗結果是否有明顯的影響。但是結合實驗的數(shù)據(jù)建議實驗動物檢測時間*好在上午9:00至下午15:00之間進行，如果有條件，且需要重復多次檢測，盡量在每天同一時間段檢測，以減少數(shù)據(jù)的波動。

3. 每次實驗結束后，用酒精檫拭場地，避免氣味干擾。

4. 動物的回避性反應差異較大，因此需要檢測大量的動物。如需減少差異或少用動物，可對動物進行預選或按學習成績好壞分檔次進行試驗。

5. 電流刺激大小需要根據(jù)每批次動物的應激情況來調(diào)節(jié)，通常小鼠刺激大小為0.2-0.5ma，大鼠為0.6-0.9ma左右。

6. 隔音箱的作用是*大限度的降低外界噪音、光線以及人為因素對實驗本身的干擾，隔音箱屬于選配組件，情況允許下建議配置。