摘要：目的通過觀察微管相關蛋白－２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ－２，ＭＡＰ－２）表達的變化研究針灸結合康復法（以后簡稱針康法）對海馬梗死大鼠學習記憶能力的影響。方法將５０只清潔級雄性ＳＤ大鼠隨機分為假手術組、模型組、針刺組、針康組和康復組，每組各１０只。采用光化學法誘導大鼠海馬梗死造模型，術后２４ｈ給予干預，１４ｄ后采用Ｙ－型迷宮測試，評價各組大鼠學習記憶能力；采用**組化法觀察各組大鼠海馬中的ＭＡＰ－２表達情況。結果（１）與假手術組比較，其他各組大鼠的學習記憶能力均明顯下降，差異具有統計學意義（Ｐ＜０．０５）。在Ｙ－迷宮試驗中，與模型組比較，其余各組學習能力均有所恢復，差異具有統計學意義（Ｐ＜０．０５），且針康組優于針刺組和康復組，差異具有統計學意義（Ｐ＜０．０５）。（２）與假手術組比較，各組大鼠的ＭＡＰ－２表達明顯，差異具有統計學意義（Ｐ＜０．０５）。與模型組相比其余各組表達更明顯，差異具有統計學意義（Ｐ＜０．０５），且針康組優于針刺組和康復組，差異具有統計學意義（Ｐ＜０．０５）。結論針康法可促進大鼠學習記憶能力的恢復、上調ＭＡＰ－２的表達，效果均優于單純的針刺和康復訓練。

關鍵詞：學習記憶；ＭＡＰ－２；針刺；康復訓練；腦梗死；大鼠

腦缺血導致患者的運動功能障礙，其功能的恢復可通過再學習而獲得，但由于患者多同時存在記憶功能的障礙，嚴重影響患者提高自身的軀體運動功能，更影響其生活質量。目前，針刺、康復訓練**缺血后記憶能力障礙的效果較好，但相關作用機制還不明確。為此，本實驗以針刺結合康復訓練作為干預手段，探討針灸結合康復的方法對海馬梗死大鼠的ＭＡＰ－２表達和學習記憶能力的影響，并試探性闡述其作用機制。

１　材料和方法

１．１　

實驗動物及分組所選試驗動物由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供［許可證號ｓｃｘｋ（京）２００９－０００１］，均為健康清潔級雄性ＳＤ大鼠，共５０只，體重

２００ｇ－２５０ｇ。將大鼠隨機分為模型組、假手術組、針刺組、康復組和針刺結合康復組（簡稱“針康組”），每組１０只大鼠。采用光化學法誘導海馬缺血模型。各組于術后２４ｈ進行干預。

１．２　

主要儀器、試劑選購于國藥集團化學試劑有限公司的虎紅粉劑；由哈爾濱工業大學提供的冷光源；上海欣軟信息科技有限公司可提供Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮、Ｙ－型迷宮；購自美國Ｓｔａｎｔ公司的ＭＡＰ－２一抗試劑盒，產品（批號２００５０７０）；購自北京中山試劑公司的二抗試 劑 盒，產 品 （批 號２００５０１２）。

１．３　

制備模型

光化學法誘導法：用１０％水合氯醛按３５ｍｇ／ｋｇ腹腔注射將大鼠麻醉，于俯臥位將大鼠放置在腦立體定位儀上，沿頭部正中將大鼠頭皮切開，暴露顱骨到前囟點，在前囟點后３．５ ｍｍ、中線向左旁開２．０ｍｍ處，用牙科鉆鉆開一個直徑為１ｍｍ的骨窗，將光纖管尾端探至硬膜下３．３ｍｍ處。用生理鹽水稀釋虎紅，濃度為１．５％，按７０ｍｇ／ｋｇ于腹腔注射，注射時間為２ｍｉｎ。５ｍｉｎ后照射局部海馬組織。照射時間５ｍｉｎ。手術結束后縫合頭皮，正常喂養。假手術組僅進行常規麻醉（沿頭顱切開頭皮，用牙科鉆在前囟后３．５ｍｍ、中線向左旁開２．０ｍｍ處鉆孔，然后縫合頭皮）。

１．４　

干預方法

針刺組：大鼠術后２４ｈ參照于致順頭部腧穴七區劃分法和《大鼠穴位針灸圖譜》，選擇０．２５ｍｍ×１５ｍｍ針具取頂區進行針刺，進針深度３－１０ｍｍ，留針６ｈ。康復組：大鼠術后２４ｈ進入Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮接受訓練，從平臺所在象限外的其他３個象限，隨機選擇一個入水點，并記錄大鼠尋找并爬上平臺的時間，即潛伏期。將大鼠面向池壁放入池中，如果大鼠２ｍｉｎ內找不到平臺，就將大鼠放到平臺上停留３０ｓ，后將其放回籠中。此種情況潛伏期記為１２０ｓ。訓練時依次從３個不同的入水點入水，每次大鼠的入水點相同，訓練的順序固定。每日訓練１次。主要訓練大鼠的游泳和學習記憶功能能力。針康組：大鼠術后２４ｈ后每日針刺留針６ｈ，Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮訓練１次。模型組：術后自然恢復，不進行任何干預。

１．５　標本采集及指標檢測

１．５．１　

標本采集

干預１４ｄ后，于大鼠檢測行為能力后灌注取材。按大鼠０．３５ｍｌ／１００ｇ體重的劑量，腹腔注射１０％水合氯醛０．５ｍｌ，將大鼠深度麻醉，打開胸腔，暴露心臟，將灌注針刺入心尖，沿左心室將管插至主動脈，固定插管，剪開右心耳，先灌注０．９％的生理鹽水，見右心耳流出澄清液體，再灌注２００ｍｌ，濃度為４％多聚甲醛固定液。完成灌注后將大鼠斷頭取腦，所取組織放于４％福爾馬林溶液中固定２４ｈ。２４ｈ后乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（從視交叉水平開始進行冠狀切片，厚度為５μｍ），采用**組織化學（Ｓ－Ｐ）法染色。

１．５．２　

指標檢測

將包埋的腦組織切片，石蠟切片先經二甲苯脫蠟，再梯度酒精脫水；取過氧化氫去離子水孵育，以阻斷內源性過氧化物酶；枸櫞酸微波修復。滴加一抗（１∶５０），４℃下冰箱過夜，ＰＢＳ沖洗，２ｍｉｎ×３次；滴加二抗，３７℃下孵育２０ｍｉｎ，ＰＢＳ沖洗，２ｍｉｎ×３次；滴加ＤＡＢ顯色劑；后用蒸餾水進行充分沖洗，蘇木素復染，用鹽酸乙醇分色、藍化；后梯度酒精脫水，二甲苯透明，*后中性樹膠封片。統計陽性細胞數，將制成切片置于放大鏡下（放大倍數為１０×４０）隨機選５個視野，顯色者為陽性，對每個視野內的陽性細胞數進行統計。

１．６　

評估學習記憶能力

采用Ｙ－型迷宮：Ｙ－型迷宮是一個三等臂式迷宮，每臂頂端設有信號燈，將**臂信號燈點亮，危險臂不點亮信號燈。訓練中每次無規則選取一**臂。大鼠在通電后從所在臂跑到亮臂記為正確，如跑到暗臂記為錯誤。每天分段訓練大鼠，每段１０次，兩段間隔２ｍｉｎ。如連續１０次測試中有９次正確表明大鼠已掌握迷宮結構，記錄大鼠掌握迷宮結構所需的訓練次，表明學習能力越強的大鼠訓練次數越少。以此可判斷大鼠學習分辨能力。

１．７　

統計方法

采用ＳＰＳＳ　１７．０統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（ｘ珚±ｓ）表示，各組組間差異采用單因素方差分析，以Ｐ＜０．０５為有顯著性差異。

２　結果

２．１　

學習記憶能力的評估

Ｙ－迷宮試驗結果顯示，各組大鼠的分辨學習能力明顯下降（與假手術組比較），差異有統計學意義（Ｐ＜０．０５）。與模型組比較，干預組學習能力均有所恢復，差異有統計學意義（Ｐ＜０．０５），且針康組療效*佳，差異有統計學意義（Ｐ＜０．０５），見表１。

２．２　

**組化檢測海馬

ＭＡＰ－２的表達梗死灶周圍ＭＡＰ－２陽性細胞明顯增多。各組大鼠的ＭＡＰ－２表達較假手術組明顯，差異有統計學意義（Ｐ＜０．０５）。與模型組比較，各干預組表達更明顯，差異有統計學意義（Ｐ＜０．０５），針康組*佳，差異具有統計學意義（Ｐ＜０．０５），見表２。

３　討論

頭針作為一種整體性**配合康復**，使患者的大腦皮層在單位**時間內獲得更大的刺激量，激發大腦皮層相對無效的或新形成的通路，使原先未承擔此功能的結構去承擔新的、不熟悉的任務，從而實現對大腦的重塑。臨床實踐中我們也發現，針灸結合康復之路可同時提高患者的肢體運動能力及認知能力，兩方面功能的提高均優于單純的針灸或康復訓練，尤其是頭針**（其中以前額部腧穴為主）療效*為突出。可見，針康法將改善患者肢體運動功能及學習功能，這正符合現代偏癱康復中的提高運動整合水平的理念。目前，針灸配合運動訓練的**方法在臨床已取得良好療效，被稱作“新趨勢針灸”（ＮＴＡ）。本實驗采取術后２４ｈ干預１４天，是因為有研究表明，腦缺血后神經元樹突生長發生可能在１周以后，而運動訓練對其生長有明顯的促進作用。

ＭＡＰ－２是一種熱穩定的磷蛋白，哺乳動物腦中含量豐富，是神經細胞的骨架成分，主要在神經元胞體、樹突和樹突棘表達，能調節微管蛋白組裝，是動力學的重要調節因子，常被用來作為神經元的標志蛋白。根據Ｂｒｉｏｎｅｓ等研究發現，短暫性腦缺血后的大鼠的表達增加，并同時表現出大鼠在水迷宮行為學參數的變化，提示ＭＡＰ－２可能發揮了提高神經功能的作用。

本實驗結果顯示，腦缺血后大鼠的分辨學習的能力明顯下降。針刺、康復訓練以及針刺結合康復均能促進學習能力的恢復，但針康法療效*佳。**組化結果 顯示，與假手術組 比較，各組 大鼠的ＭＡＰ－２表達均較對照組明顯，差異具有統計學意義（

Ｐ＜０．０５）。與模型組比較，受干預組表達更明顯，差異具有統計學意義（Ｐ＜０．０５），且針康組效果*明顯，差異具有統計學意義（Ｐ＞０．０５）。表明單純康復訓練、單純針刺與針刺結合康復訓練均能明顯促進神經元樹突發芽和再生，進一步促進新的突觸形成，而后者作用更明顯。本實驗中ＭＡＰ－２蛋白表達增加的同時有腦梗死大鼠行為學的改善，并且與學習記憶功能的恢復呈正相關。表明針刺結合康復訓練可明顯促進腦缺血大鼠神經功能，改善學習記憶能力。進而促進其軀體運動功能恢復的效率，提高生活質量。在今后的實驗中，我們爭取能夠對腦卒中患者的其他功能康復做更為廣泛的深入研究。