摘要 目的：探討黃連**湯對衰老小鼠的抗衰老作用及其機制。方法：采用皮下注射Ｄ－半乳糖的方法制備衰老小鼠模型。將ＩＣＲ小鼠隨機分為正常對照組、模型組、１、２、４和８ｇ／ｋｇ黃連**湯生藥量處理組，采用自發活動實驗檢測小鼠的自主活動，用跳臺實驗檢測小鼠的學習記憶能力，用硫代***酸法和黃嘌呤氧化酶法測定腦組 織 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ＳＯＤ）和 丙 二 醛（ＭＤＡ）含量。結果：與正常對照組相比，模型組小鼠的學習記憶能力減退，ＭＤＡ含量增加，ＳＯＤ活性降低。黃連**湯各劑量組小鼠的學習記憶能力明顯改善，與１ｇ／ｋｇ和８ｇ／ｋｇ相比，２ｇ／ｋｇ和４ｇ／ｋｇ黃連**湯組小鼠腦內的ＭＤＡ含量明顯降低，ＳＯＤ活性顯著增高。結論：黃連**湯能顯著改善Ｄ－半乳糖衰老小鼠學習記憶能力，其機制可能與其抗氧化特性有關。黃連**湯對衰老小鼠學習記憶自發活動的影響。
關鍵詞 黃連**湯；Ｄ－半乳糖；衰老；抗氧化
衰老是由多種復雜因素相互作用引起的生物學過程，是生命周期中按一定規律發生在機體、器官、組織細胞的形態和功能的演變過程。在動物衰老模型中，由中國學者提出的利用大劑量Ｄ－半乳糖造成動物的糖代謝障礙，進而影響蛋白質代謝和脂類代謝，致使動物組織、細胞出現一系列退行性變化，較為符合人類自然衰老時所出現的癥狀。
黃連**湯（ｈｕａｎｇｌｉａｎ－ｊｉａｎ－ｄｕ－ｔａｎｇ，ＨＪＤＴ）出自《外臺秘要》，由黃連、黃芩、黃柏和梔子４味生藥組成，為清熱**的經典方劑。近年來，國內外醫藥學界對ＨＪＤＴ的現代藥理學研究中，應用了大量的實驗方法和動物模型對其進行了多方面的研究。結果表明，ＨＪＤＴ具有保護肝損傷及改善腦缺血等作用，在對ＡＰＰ／ＰＳ１雙轉基因阿爾茨海默病（ＡＤ）小鼠的研究中，發現ＨＪＤＴ可能通過提高抗氧化能力，對ＡＤ小鼠海馬神經細胞起到保護作用。但是，ＨＪＤＴ對Ｄ－半乳糖致衰老小鼠的作用尚未見報道。本實驗通過Ｄ－半乳糖致衰老模型，觀察ＨＪＤＴ對亞急性衰老小鼠的行為學以及腦組織中的超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和丙二醛（ＭＤＡ）含量的影響，進一步為黃連**湯預防衰老作用提供科學依據。
１ 材料與方法
１．１ 藥品與試劑 Ｄ－半乳糖購自ａｍｒｅｓｃｏ公司（批號：２０３２Ｃ１４９）。黃連**湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子按３∶３∶２∶３比例混合，藥材購自浙江省華東醫藥股份有限公司并經鑒定，加水浸泡１ｈ，水煎２次，煎液濃縮至生藥含量為２ｇ／ｍＬ，ｐＨ ７．０。考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、ＳＯＤ（批號：２０１２１２２８）、ＭＤＡ（批號：２０１２１２３１）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。
１．２ 動物與分組
ＩＣＲ小鼠９０只，雌雄各半，體重２３～２７ｇ，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供［實驗動物合格證：ＳＣＸＫ（滬）２００７－０００５］。所有的動物實驗均遵照國家實驗動物飼養管理和使用指南，動物飼養在溫度控制的環境（２２±２）℃下，１２ｈ明暗循環，自由飲食和飲水。動物隨機分為正常對照組、衰老模型組、ＨＪＤＴ １、２、４和８ｇ／ｋｇ組，每組１５只。小鼠在實驗室適應１周后，采取頸背部皮下注射的方法，衰老模型組及各給藥組給予Ｄ－半乳糖溶液１５０ｍｇ／ｋｇ，正常對照組給予等量生理鹽水，每日１次，連續１２周。其中后６周，ＨＪＤＴ各組增加灌胃給予ＨＪＤＴ １、２、４和８ｇ／ｋｇ。正常對照組和衰老模型組增加灌胃給予同等量生理鹽水，每日１次。
實驗當天，先將小鼠放到自發活動實驗室適應環境１ｈ。將小鼠頭朝前輕輕放入活動箱中央，關上箱門，拍攝記錄自發活動１ｈ。實驗結束后，采用小鼠自發活動計算機圖像分析系統，提取活動軌跡及小鼠在開場各區域的活動路程、停留次數、停留時間等指標。
１．４ 跳臺試驗
小鼠跳臺試驗反射箱由不透明有機玻璃分隔為５間，箱底為銅柵，通以３６Ｖ電流，每間設置一高為３．０ｃｍ、直徑為３．２ｃｍ橡皮墊作為動物回避電擊的**區。實驗時，將小鼠置于箱中，自由活動５ｍｉｎ，然后將其置于**臺上，箱底通電，觀察其跳臺的潛伏期（ｌａｔｅｎｃｙ，Ｌ）并記錄５ｍｉｎ內小鼠跳下臺的次數，即錯誤次數（ｍｉｓｔａｋｅ，Ｍ），此為訓練成績，２４ｈ后再測為測試成績。
１．５ ＳＯＤ和ＭＤＡ等生化指標含量測定
小鼠腦組織用濾紙拭干后，精密稱重并盡快剪碎與冷生理鹽水按體積比１∶９混合，用勻漿器打勻后離心１０ｍｉｎ，分離出上清液即得１０％的組織勻漿，按照試劑盒說明書方法測定ＭＤＡ含量（硫代***酸法）。將１０％組織勻漿稀釋１０倍后按照試劑盒說明書方法分別測定ＳＯＤ活性（黃嘌呤氧化酶法）和蛋白含量（考馬斯亮藍顯色法）。黃連**湯對衰老小鼠學習記憶自發活動的影響
１．６ 統計學處理
實驗數據以均數±標準差（ｘ±ｓ）表示，多組均數間比較采用Ｏｎｅ－ＡＮＯＶＡ檢驗，兩兩比較采用Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ法。Ｐ＜０．０５表示差異有統計學意義。
２ 結果
２．１ ＨＪＤＴ對衰老小鼠自發活動的影響 與正常對照組相比，衰老模型組在總路程、中央路程和中央時間有減小的趨勢，但無統計學意義（表１，Ｐ＞０．０５）。ＨＪＤＴ各劑量組與衰老模型組相比也均無統計學差異（表１，Ｐ＞０．０５）
２．２ ＨＪＤＴ對衰老小鼠腦組織ＳＯＤ、ＭＤＡ含量的影響 與正常對照組相比，模型組腦組織ＳＯＤ含量明顯降低，而ＭＤＡ含量顯著升高（圖１～２，Ｐ＜０．０１）。與衰老模型組相比，ＨＪＤＴ ２、４ｇ／ｋｇ組腦組織ＳＯＤ含量顯著提高（圖１，Ｐ＜０．０５）、ＨＪＤＴ ２、４、８ｇ／ｋｇ組ＭＤＡ含量顯著降低（圖２，Ｐ＜０．０５）。
２．３ ＨＪＤＴ對衰老小鼠跳臺試驗的影響 與正常對照組相比，模型組在跳臺試驗的測試中，潛伏期明顯縮短，錯誤次數顯著增加（圖３～４，Ｐ＜０．０１）。而ＨＪＤＴ １、２、４ｇ／ｋｇ能明顯延長潛伏期（圖３，Ｐ＜０．０５），１、２、４、８ｇ／ｋｇ減少錯誤次數（圖４，Ｐ＜０．０１）。
３ 討論
衰老是生命進程中不可避免的生理功能的退化過程，這個過程包括認知功能障礙、神經功能障礙等方面，在較短時間內連續給動物注射大劑量的Ｄ－半乳糖，在半乳糖氧化酶的作用下可以轉變成醛糖和氫過氧化物，從而導致過氧化物陰離子和氧自由基的大量生成和堆積，影響正常滲透壓，引起細胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，導致神經元線粒體結構損傷，學習記憶能力顯著下降，引起衰老。而腦衰老的特征表現為認知功能和活動能力等方面的行為缺陷，這與氧化損傷和炎癥密切相關，氧化性損傷成為衰老和其他與衰老相關的如ＡＤ、帕金森病（ＰＤ）等**的關鍵。ＳＯＤ是體內重要的抗氧化酶，可以通過歧化作用**超氧陰離子自由基，從而保護機體的細胞和組織，延緩衰老過程。但隨著年齡的增長，機體**自由 基 的 能 力 下 降，產 生 大 量 代 謝 產 物 如ＭＤＡ，ＭＤＡ會通過降低膜的流動性以及改變膜結合蛋白的結構和功能引起細胞膜的損傷，進而加速機體衰老。因此ＳＯＤ含量的高低可以間接反映機體**自由基的能力，而ＭＤＡ含量的高低可以間接反映細胞的衰老程度。
近年來在**神經性損傷方面的大量研究表明，ＨＪＤＴ在腦缺血、腦缺氧模型中可降低大鼠腦、肝、胰組織的ＭＤＡ含量，抑制過氧化脂質的生成及消除氧自由基作用。能促進腦缺血動物學習記憶行為，其作用機制可能與減少腦中自由基終產物ＭＤＡ含量、增加大腦皮質和海馬組織腦血流量有關。在ＡＤ大鼠模型中，黃連**湯可以調整其**功能和增加**能力。本實驗結果顯示，ＨＪＤＴ可以增加由Ｄ－半乳糖引起的衰老小鼠的ＳＯＤ活性，減少ＭＤＡ的產生。在行為學方面，模型組和ＨＪＤＴ各組對自發活動中總路程、中央區的活動路程以及中央區活動時間無顯著影響，但在跳臺試驗中，ＨＪＤＴ能夠延長跳臺實驗中的潛伏期，減少錯誤次數，相對于模型組，表現為學習記憶能力有所提高。提示其作用機制可能與其增強對氧自由基的**作用，減少體內氧自由基的產生，改善Ｄ－半乳糖引起的氧化應激損傷，防止細胞內Ｃａ２＋超載從而起到抗氧化，抗衰老的作用有關，其具體機制還有待于進一步的研 究。從 藥 物 的 劑 量 上 看，以２ｇ／ｋｇ和４ｇ／ｋｇ劑 量 的ＨＪＤＴ的 效 果 較 為 明 顯，而８ｇ／ｋｇ的劑量在ＳＯＤ含量及跳臺試驗中均作用不大。
綜上所述，中等劑量的ＨＪＤＴ能通過提高腦組織ＳＯＤ活性和降低ＭＤＡ含量，能有效地改善Ｄ－半乳糖衰老小鼠學習和記憶能力。
