新物體識別實驗與Morris水迷宮實驗比較

【摘要】目的應用物體識別方法研究D2半乳糖長期注射致腦老化小鼠模型的學習記憶能力,并比較物體識別方法與Morris 水迷宮方法對該模型測試的靈敏性。方法C57BL/ 6 小鼠,隨機分成正常對照組、D2半乳糖低劑量組(50mg/ kg ,sc) 、D2半乳糖高劑量組(100mg/ kg ,sc) ,連續造模8 周。以物體識別方法和Morris 水迷宮方法測試各組動物的學習記憶能力。結果在物體識別測試中, D2半乳糖高劑量組分辨指數(15. 71 ±3. 94) 較對照組(45. 89 ±7. 41) 減低具有非常顯著性意義( P < 0. 001) ,低劑量分辨指數(24. 69 ±6. 25) 與對照組的差異也存在顯著性意義( P < 0. 05) 。在Morris 水迷宮測試中,D2半乳糖高劑量組動物逃逸潛伏期比對照組延長有顯著性意義( P < 0. 01) ;高劑量組在目標象限空間探索所停留時間與游泳距離比均較正常對照組減少有顯著性意義( P < 0. 05) 。結論D2半乳糖可導致小鼠出現顯著的物體識別能力障礙,用物體識別測試方法比Morris 水迷宮方法更靈敏地反映該模型小鼠的學習記憶障礙。

【關鍵詞】D2半乳糖; 學習記憶; 物體識別; 水迷宮; 腦老化

一、實驗概述

物體識別測試(Object Recognition Test) 是利用動物先天對新物體有探索傾向的原理而建立的學習記憶測試方法。該方法具有讓鼠在自由活動狀態下進行學習記憶測試的特點,能更近似地模擬人類的學習記憶行為。本研究擬應用物體識別方法研究D2半乳糖長期注射致腦老化小鼠模型的學習記憶能力,并與水迷宮行為學測試相比較,為促進物體識別測試方法在我

國學術界的應用提供借鑒材料。

因C57BL/ 6 近交系小鼠已被證明有良好物體識別與空間記憶能力, 以及隨衰老而記憶力減退規律,本實驗選用C57BL/ 6 小鼠,3 月齡,雌性,體質量(20 ±2) g ,購于北京大學醫學部動物中心(許可證號:SCXK(京) 200220001) ,適應性飼養一周后,隨機分成正常對照組、D2半乳糖低劑量組、D2半乳糖高劑量組。小鼠均在無特殊致病原(SPF) 級動物室飼養至行為學測試前。低劑量組每日于背部皮下注射D2半乳糖(購自Sigma 公司, G5388) 50mg/ kg ,高劑量組每日皮下注射D2半乳糖100mg/ kg ,對照組注射等量生理鹽水,連續8 周。

二、行為學測試

1. 物體識別試驗: 造模8 周后, 參考Ennaceur等方法進行物體識別試驗,裝置主要由一個測試盒(自制) 與2 套(每套2 只) 測試物體組成,測試物體在實驗前經篩選有近似的小鼠喜好程度。本實驗測試盒以45cm ×35cm ×20 cm 的乳白色硬塑料方盒自制而成。（備注：物體識別實驗系統可以選購上海欣軟公司研發的SuperMaze軟件，型號為XR-XX117），物體A 套為藍色方形硬塑兒童玩具,約4. 5cm ×4. 5cm ×5 cm ,B 為白色圓柱形塑料盒,底面直徑4cm ,高7cm ,兩物體均足夠重以防止小鼠推動。測試環境要求在隔音、避光的場所。在測試盒上方以60W 白光燈照射使盒內無陰影處。

測試主要分適應期、熟悉期和識別期：

第1 天為適應期:在上述條件下,將鼠放入測試盒的中間,盒內未放任何物體,讓其自行適應性活動10min。

第2 天為熟悉期: 在測試盒中放入2 個相同的玩具(AA 或BB) ,距離長軸(45cm) 兩側壁8cm ,將鼠從盒中距物體等距離處放入。測試者兩手各握1 只秒表(上海秒表廠) ,每只秒表對著1 個動物,開始紀錄其在每個物體上的探索時間(以鼠嘴湊近物體約2cm 范圍內計時,鼠爬在玩具上玩或者只是在物體附近走則能計入) ,以秒表間斷累積計時測定鼠探索每個物體的時間總和,為在第3 天的計時提供練習。

第3 天為識別測試期:將另外一套中的一個物體替換前**中的一個玩具放入盒內(AB 或BA) ,將鼠放在盒中距兩物體等距離處10min。每只鼠測試完成后,用酒精擦拭物體以消除鼠停留在物體上的氣味,并且按次序輪流調換各物體在盒內的位置,以消除鼠對物體在盒內位置喜好程度不同而帶來的影響。為進一步減少兩種物體本身差異對鼠探索時間比較的影響,本實驗以兩位測試者在同一實驗室內用兩個相同裝置測試每組的一半動物,但兩裝置中的物體

相對應鼠的新舊次序相反(如A 在一測試者為新物體在另一測試者則為舊物體) 。鼠的物體識別能力以第3 天探索新舊物體的時間,并以探索時間計算分辨指數(discrimination index ,DI) 來評價。分辨指數計算公式為:DI = (N-F) / (N + F) ×100 % ,式中N 為在探索新物體所用的時間,F 為探索舊物體所用的時間。

2. Morris 水迷宮:由4d 的訓練期和第5天的空間探索試驗組成,見參考文獻。

三、統計方法

各組動物在物體識別試驗的新舊物體探索時間、分辨指數和在水迷宮空間探索中在目標象限所停留時間與距離比以單因素方差分析結合Post Hoc2Duncan法進行組間比較分析;4d Morris 水迷宮中的逃逸潛伏期(從入水到找到站臺的時間) 以重復測量的雙因素方差分析進行比較分析。數據以x ±s 表示。

四、討論

D2半乳糖長期皮下注射可導致小鼠出現顯著的物體識別記憶能力障礙。而且用物體識別測試方法比Morris 水迷宮方法更靈敏地反映該模型小鼠的學習記憶障礙。鼠的物體識別能力與海馬、基底前腦和嗅周皮層等腦區功能有關,受自由基損傷以及腦內單胺遞質含量等因素影響。Morris水迷宮測試的空間學習記憶能力與海馬、紋狀體、基底前腦、小腦等腦功能區域有關。D半乳糖可造成鼠腦皮層與海馬自由基損傷、腦內單胺遞質含量減少,可能是導致其物體識別以及空間學習記憶能力減低的原因。

Luparini 等發現在物體識別測試中出現的老年鼠輕度記憶損害現象在Morris 水迷宮測試中消失,與我們的研究結果類似。造成這兩種學習記憶測試方法敏感性不同的可能原因有二: ①鼠的精神狀態。在物體識別測試中,鼠始終處于自主活動的狀態,是在日常精神穩定狀態下進行的測試;而在水迷宮中,鼠去找平臺是在害怕沉水的應激下進行,應激本身可導致學

習記憶能力下降。②兩種行為測試方法所依賴的腦功能區域不同。近年來的研究證據表明,物體識別與嗅皮質或嗅周皮質有高度相關,如細胞毒性造成大鼠的嗅皮質損傷只造成物體識別能力損害而空間記憶保持 ,而空間學習記憶能力似乎比物體識別記憶更依賴于海馬功能,如海馬CA3 區域的部分損傷以及后海馬的神經毒性損傷可導致Morris 水迷宮空間識別障礙而無物體識別能力的損傷表現,D2半乳糖致腦老化鼠在嗅周皮質的損傷是否比在海馬區損傷嚴重值得進一步研究。

我們應用物體識別測試方法的體會主要有: ①在測試盒內光線要充足,不能留有陰暗處或裂縫; ②測試物體在要實驗前作鼠喜好性篩選,并且足夠大以引起鼠的注意; ③測試者在測試第2 天需訓練秒表間斷連續計時法以使第3 天能熟練計時; ④測試過程中更換兩物體在測試盒內的位置,并只在鼠探索物體時才計時; ⑤該法測試時間相對長,在需測動物數較多時可以兩人同時進行。總之,物體識別測試方法簡便、靈敏,適合學習記憶功能障礙的機理及**學研究。新物體識別實驗與Morris水迷宮實驗比較

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