Morris水迷宮實驗、避暗實驗對子代小鼠學習記憶能力的影響機制
Ø 【摘 要】
目的 探討富含α- 亞麻酸(α- LNA) 的胡麻籽油( 亞麻油) 對子代小鼠腦發育及功能的影響。方法取性成熟小鼠45只,雌雄為2 ∶1 , 將懷孕雌鼠隨機分為4 組, 分別給予胡麻籽油2 g (A組) 、5 g (B組) 、10 g (C組) /kg 體重和對照組(0組) , 連續給孕鼠經口灌胃至仔鼠斷乳,母鼠處死, 將仔鼠雌雄分籠, 雄鼠立即處死進行腦體重量測定并計算腦體比; 再將雌鼠C組分為C 組和D 組, A、B、C 組雌鼠繼續按母鼠劑量補充胡麻籽油, 每天1次, D 組不補充胡麻油繼續喂養; 5 周后進行小鼠避暗和水迷宮實驗, 測定后取腦進行蛋白質(TPRO) 、乙酰膽堿脂酶( AChE )及一氧化氮(NO) 指標測定。結果 ①子鼠體重隨劑量的增加而下降, C組下降明顯, 與對照組比較差異有統計學意義( P<0.05) , 腦體比各組之間差異無統計學意義(P>0.05) 。②水迷宮實驗結果顯示: B 組、D 組與對照組比較游泳時間縮短, 錯誤次數減少( P<0.05 ) ; 小鼠避暗實驗結果顯示各劑量組的潛伏期較對照組延長, 而錯誤次數減少, 但差異無統計學意義。③TPRO 隨劑量的增加而增高, D 組較0 組和A 組明顯增高, 差異有統計學意義（P<0.05) ; Ac hE 各組之間差異無統計學意義; NO 含量A 組較C 組有明顯增高(P<0.05) , 較B、D 組差異有統計學意義( P<0.01 ) 。結論 在小鼠胚胎期及嬰幼期補充胡麻籽油可提高腦內蛋白質含量, 促進小鼠學習記憶能力, 可引起腦內NO 含量的變化。儀器參考網站上海欣軟公司www.dzmykt.com。
Ø 【關鍵詞】
α- 亞麻酸; 記憶; 神經遞質; 亞麻籽油
胡麻籽油又稱亞麻籽油, 是我國西北和晉西北等地區主要的食用油, 資料顯示, 胡麻籽油中α- 亞麻酸(α- LNA) 含量達61.27%[ 1] 是植物油中含量*高的。α- LNA 為n - 3 系多不飽和脂肪酸,是人體必需脂肪酸, 在體內可有效地轉變為二十碳五烯酸(EPA) 和二十二碳六烯酸(DHA) , 而發揮其生理功能。多年來關于n - 3 系多不飽和脂肪酸, 尤其是DHA( 魚油的主要成分) 在促進大腦發育及視網膜功能方面的作用被研究證實; 此外與胡麻籽油結構及α- LNA 含量相近( 50%以上) 的紫蘇籽油被實驗證明有促進小鼠學習記憶的作用。本實驗以胡麻籽油作為α- LNA 的來源, 對攝入胡麻籽油的小鼠進行了學習記憶及腦內部分神經遞質的測試, 以觀察胡麻籽油對胚胎及生長發育期小鼠腦發育的影響,為更好開發胡麻籽油提供依據。
Ø 材料與方法
1.1 樣品來源
胡麻籽油: 產自山西省五寨縣, 胡麻籽經超臨界CO2 提取,α- LNA 含量為50.50% 。
1.2 實驗動物與基礎飼料
選性成熟昆明種小鼠45 只, 雌性30 只, 雄性15 只; 實驗動物和飼料均購自山西醫科大學實驗動物中心。
1.3 儀器
小鼠水迷宮儀、XR-XC105 型小鼠被動回避條件反射儀;1.4 試劑一氧化氮( NO) 、乙酰膽堿酯酶( AChE ) 和蛋白質( TPRO) 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,其余試劑均為市售分析純。Morris水迷宮系統可由上海欣軟信息科技有限公司提供。
1.5 實驗方法
1.5.1 劑量分組與喂養: 選性成熟小鼠雌性30 只,雄性15 只, 以2 ∶1 進行合籠, 次晨以查到精子為受孕0 d , 自妊娠0 d 起雌鼠分籠飼養, 將孕鼠隨機分為4 組, 即A、B、C 3 個劑量組和一個對照組( 0 組) ,在受孕第0 天起分別給予A、B、C 為2 、5 、10 g/kg 體重的胡麻籽油, 連續灌胃至子鼠斷乳, 新生鼠出生后調整每窩仔鼠數6～9 只, 將斷乳仔鼠雌雄分開, 雄鼠立即處死進行腦體重量測定并計算腦體比; 將雌鼠C 組分為數量相同兩組即C 和D 組, 除D 組不給胡麻籽油外, 其余繼續按母鼠劑量補充胡麻籽油, 每天1 次, 連續5 周。
1.5.2 腦重測定: 分別取斷乳和56 d 齡子鼠稱重,斷頭后取腦組織稱重, 計算腦體比。
1.5.3 小鼠水迷宮實驗: 將補充胡麻籽油5 周后仔鼠每組隨機選10 只開始訓練, 訓練期間繼續給受試物, 每天1 次。迷宮泳道水深15 cm, 水溫( 25±1 ) ℃。實驗時, 將小鼠放于泳道的起點處, 開始計時, 觀察其到達終點所需時間, 以及出現錯誤次數。將小鼠訓練時間限定為120 s , 在120 s 內未到達終點的小鼠均記為120 s 。共訓練5 d , 末次從起點進行訓練。*后計算各組動物的錯誤次數, 到達終點的時間及到達終點的動物數。
1.5.4 小鼠避暗實驗: 將補充胡麻籽油5 周后仔鼠每組隨機選10 只, 進行避暗實驗, 記錄每鼠從放入明室到進入暗室遭電擊所需的時間, 此即潛伏期, 訓練5 min , 并記錄5 min 內電擊次數, 24 h 后重做測驗, 記錄每只動物進入暗室的潛伏期和5 min 內的電擊次數, 以此作為記憶的成績。
1.5.5 TPRO、NO、AChE 的測定: 測試完水迷宮實驗的小鼠處死, 取腦在4 ℃下勻漿, 進行TPRO、AChE和NO 測定, 方法由南京建成生物工程研究所提供。
1.6 統計學分析
用統計軟件SPSS 10.0 進行統計分析, 采用單因素方差分析、泊松分布及非參數統計方法。
Ø 結 果
2.1 腦體比: 表1 結果顯示斷乳期小鼠體重、腦體比各組間比較差異無統計學意義( P >0.05 ) ,而56 d 齡小鼠隨劑量的增加體重明顯下降, C 組與各劑量組比較差異有統計學意義( P <0.05 ) , 腦體比C 組也相對增加, 較對照組差異有統計學意義( P<0.05 ) 。
2.2 小鼠學習記憶實驗: 見表2 。從表2 結果顯示小鼠游出迷宮游出時間B 組與D 組縮短, 錯誤次數減少, 與對照組比較差異有統計學意義( P<0.05 ) 。小鼠避暗潛伏期劑量組有延長趨勢, 錯誤次數減少, 但與對照組比較差異無統計學意義( P>0.05 ) 。
2.3 小鼠腦組織TPRO、NO、AChE 測定結果TPRO 含量有明顯的劑量反應關系, D 組較0 組和A 組明顯增高, 差異有統計學意義, D:0 為P <0.01 , D:A 為P <0.05 ; NO 測定中, B、C、D 組較對照組明顯降低, A 組增高明顯, 與C 組比較差異有統計學意義( P<0.05 ) , A 組與B、D 組比較差異有統計學意義( P <0.01 ) , A 組與0 組比較差異無統計學意義; AChE 雖比B、C 組明顯增高, 但各組比較差異無統計學意義。
Ø 討 論
本實驗在孕乳期至子鼠56 d 齡期間分別給孕母鼠及子鼠補充胡麻籽油作為α- LNA 的來源, 經行為學測試結果表明胡麻籽油有促進小鼠學習與記憶的作用, 與紫蘇油促進小鼠學習記憶能力的研究報道相符, 但其作用與攝入量不成正比, C 組作用減弱, 這可能與過量的不飽和脂肪酸攝入產生脂質過氧化有關, 有待進一步研究。而且D 組學習記憶能力的明顯增強也表明即使在斷乳后終止補充α- LNA, 子鼠從母體獲取n- 3 系列多不飽和脂肪酸仍能發揮其生物效應。在胚胎及嬰兒腦神經系統發育的****需要補充更多n - 3 系列多不飽和脂肪酸, 而此階段動物腦和肝臟合成DHA 的酶系統不健全, 去飽和酶活力水平較低, 在嬰兒體內利用α- LNA 合成DHA 的能力很低, 其主要從母體和乳汁中獲得。另據報道DHA 在妊娠期和嬰兒期快速積累于嬰兒組織中, 其來源于母體的貯備, 即孕期由膳食直接供給或由膳食中α- LNA 在體內的合成, 通過胎盤選擇轉運完成。因而給孕鼠補充α- LNA 對促進子鼠腦發育是有益的。
TPRO、NO 與AchE 與腦功能有密切關系, 學習記憶時蛋白質合成增加并有新的蛋白質或肽產生, 蛋白質水平影響子代腦發育和功能。本實驗腦內蛋白質含量隨劑量的增加而增高, 表明α- LNA 能影響腦蛋白質的合成從而影響腦發育及功能; NO 是近年來被認識的一種神經遞質, 釋放適量的NO 可促進學習能力, 并通過實驗得出NO 對初生小鼠學習記憶過程及記憶的再現起中心調控作用。本實驗對56 d 齡子鼠腦NO 測試顯示在不同劑量組較0組有升高也有下降, A 組明顯升高, 但與0 組比較差異無統計學意義, A 組與C 組差異有統計學意義( P<0.05 ) , B、D 組比較差異有統計學意義( P<0.01 ) 。表明攝入不同劑量的α- LNA 對腦內NO 影響各異, 是否與其中心調控作用有關及其他原因有待進一步探討; 乙酰膽堿是腦內的神經遞質, 與認知、學習、記憶等大腦**神經功能有關, 學習、記憶任務的完成伴隨著腦內乙酰膽堿的變化。AChE 是乙酰膽堿的分解酶, 它的活力變化可間接反映腦內乙酰膽堿含量。
