摘要：
頸髓病是由于脊柱退行變?cè)斐傻募顾璧穆圆糠质軌核隆２还茉趺礃樱灶i髓受壓的確切機(jī)制還沒(méi)有完全清楚。本研究的目的旨在建立一種有效的新的沒(méi)有錐板切除的慢性脊髓壓迫動(dòng)物模型，來(lái)復(fù)制臨床過(guò)程。系在一塊塑料板上的聚乙烯線，用來(lái)綁在一個(gè)月大的大鼠的C4椎體上，纏繞三圈。術(shù)后，隨著椎管和椎體的生長(zhǎng)，聚乙烯線逐漸長(zhǎng)入椎管背側(cè)的骨頭里，而產(chǎn)生脊髓漸進(jìn)性的壓縮。結(jié)果表明：在形成頸椎管狹窄9個(gè)月后，頸椎管狹窄模型的大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙和感覺(jué)障礙；然而，直到6個(gè)月才出現(xiàn)臨床癥狀。12個(gè)月后，70%的頸椎管狹窄模型大鼠出現(xiàn)了脊髓內(nèi)高信號(hào)。在病理切片，在形成頸椎管狹窄12個(gè)月后脊髓整個(gè)周圍壓縮。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目減少，白質(zhì)顯示華勒氏變性。本模型也許能夠復(fù)制臨床慢性頸髓壓迫的特征性臨床特點(diǎn)，包括在潛伏期和隱形神經(jīng)云減少后出現(xiàn)，進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能，以及代表了人類慢性頸髓壓迫。

關(guān)鍵字：動(dòng)物研究；行為評(píng)估；核磁共振；神經(jīng)元死亡；脊髓損傷。

引言：
一般認(rèn)為，慢性壓迫脊髓病的病因與頸椎的病理特點(diǎn)相關(guān)，例如椎關(guān)節(jié)硬化，韌帶骨化，椎管狹窄，以及椎間盤突出，或許由機(jī)械性壓迫和血管病變兩種因素引起所致。慢性壓迫性脊髓病隱匿性地和進(jìn)展性地?fù)p傷運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)動(dòng)能。很多病人數(shù)年沒(méi)有臨床癥狀，盡管這個(gè)時(shí)期內(nèi)存在脊髓壓迫和缺陷，一旦本**出現(xiàn)臨床癥狀，神功功能障礙進(jìn)行性加重，很少有逆轉(zhuǎn)。隨機(jī)選擇的有癥狀隊(duì)列的頸部核磁共振檢查的一項(xiàng)研究表明大于64歲的受試者26%出現(xiàn)脊髓損傷，45-64歲受試者16%出現(xiàn)脊髓損傷。臨床上，即使那些由神經(jīng)影像學(xué)確診的嚴(yán)重，檢查經(jīng)常顯示不可預(yù)料的非重要性神經(jīng)功能發(fā)現(xiàn)，和手術(shù)減壓后的可觀的神經(jīng)恢復(fù)也許是可以預(yù)料到。因此，慢性脊髓壓迫的一個(gè)急性脊髓損傷沒(méi)有的特點(diǎn)就是脊髓的可塑性。到目前為止，臨床上慢性頸髓術(shù)后效果在持續(xù)提高。不管怎樣，仍有一些不滿意的結(jié)果，即使是充分的減壓手術(shù)。這就意味著，頸髓嚴(yán)重受損以至于在病程中恢復(fù)性小。損傷過(guò)程的確切病理機(jī)制仍然不是完全清楚，但是灌注不足和血管栓塞已經(jīng)被證實(shí)是可能因素。尸體標(biāo)本的脊髓病理檢查發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元減少以及灰質(zhì)中的血管退行性變，以及脫髓鞘和軸索水腫。一個(gè)次病理情況的合適的模型應(yīng)該展示壓縮引入后的隱匿性神經(jīng)功能障礙的隱匿期，隨后進(jìn)行性的功能障礙時(shí)期。進(jìn)一步，做一個(gè)沒(méi)有脊髓損傷的模型具有重要意義。此研究的旨在產(chǎn)生一種新的脊髓慢性壓迫損傷模型，來(lái)滿足這些臨床條件，運(yùn)用MRI和病理學(xué)檢查來(lái)評(píng)估運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能。
材料：
動(dòng)物
本實(shí)驗(yàn)在當(dāng)?shù)貏?dòng)物倫理委員會(huì)和本大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)監(jiān)督條例以及日本政府動(dòng)物保護(hù)和管理法規(guī)與日本政府飼養(yǎng)動(dòng)物通知的監(jiān)督下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用27只雄性SD大鼠，3周大，平均體重51g。在溫度22度，濕度55%實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)動(dòng)物，同時(shí)能夠自由獲取飲水和食物。
頸椎管狹窄模型的制作
術(shù)前，動(dòng)物在籠子中飼養(yǎng)一周，以適應(yīng)環(huán)境。用****鈉腹腔內(nèi)注射麻醉（35mg/kg)。每只大鼠均俯臥位置于加熱板上，手術(shù)在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行。體溫保持在37°C，血壓用無(wú)創(chuàng)血壓監(jiān)護(hù)儀監(jiān)護(hù)，以保持術(shù)中平穩(wěn)的生理狀態(tài)。以C4棘突為中心，做一縱行皮膚切口，從錐板上鈍性兩側(cè)椎旁肌。暴露雙側(cè)錐板，在顯微鏡下分離出C4、C5根部，并切除。然后，切除C4棘突，實(shí)行椎板去皮質(zhì)術(shù)。C4左側(cè)從側(cè)面牽拉到一側(cè)，聚乙烯通過(guò)C4椎體的腹側(cè)，固定在一塊1*2*0.5mm 大小的抵在C4椎體腹側(cè)上的塑料片上，然后纏繞三圈固定。在本模型中，隨著椎管和椎體的生長(zhǎng)，聚乙烯線逐漸長(zhǎng)入椎管的椎板里。因此形成漸進(jìn)性的脊髓壓迫。對(duì)照組只進(jìn)行C4C5椎板的暴露，不進(jìn)行捆扎。對(duì)照組10只大鼠，控制組10只大鼠，術(shù)后繼續(xù)在以上描述的實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)12個(gè)月。
神經(jīng)功能評(píng)價(jià)
BBB評(píng)分。術(shù)后1,3,6,9,12個(gè)月每組用BBB評(píng)分評(píng)價(jià)神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能。BBB評(píng)分主要用于實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)言之，BBB是21分序列，從0（沒(méi)有后肢移動(dòng)）到21分（持續(xù)協(xié)調(diào)的后肢運(yùn)動(dòng)）。0-7分為恢復(fù)的早期階段，8-13分描述恢復(fù)期的中間階段，14-21代表恢復(fù)的晚期階段，用階段性的腳趾頭的清理，主要爪子為止，步態(tài)穩(wěn)定性，指甲位置。兩名檢查者觀察和評(píng)價(jià)每只大鼠4-min的運(yùn)動(dòng)。神經(jīng)檢查運(yùn)用雙盲技術(shù)。
核磁共振研究
MRI研究：核磁共振研究在術(shù)后3、6、9、12個(gè)月，用0.4T永磁儀。檢查系列包括T1(350/25),T2O(5000/119),視野150mm，5mm厚度層面，256*256矩陣，以及4個(gè)激發(fā)點(diǎn)。掃描時(shí)間為5-6分鐘。所有的動(dòng)物在俯臥位掃描，頸段被放置在線圈的中央，位于靜態(tài)磁場(chǎng)的等中心點(diǎn)。
脊髓的橫斷面積和壓迫率，由運(yùn)用MR圖像數(shù)字轉(zhuǎn)化儀，T1加權(quán)像矢狀面通過(guò)*大壓迫水平的區(qū)域獲得。壓迫率由前后直徑脊髓的橫斷面的直徑。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的脊髓的壓迫率和橫斷面積進(jìn)行比較。
髓內(nèi)高信號(hào)區(qū)域的有無(wú)用T2加權(quán)性像來(lái)檢查。定量測(cè)量由ROI技術(shù)來(lái)測(cè)量頸段脊髓的高信號(hào)。所有序列的SDNRS被用來(lái)評(píng)價(jià)頸段脊髓來(lái)評(píng)價(jià)脊髓和其椎管內(nèi)的周圍組織。SDNRS由單獨(dú)測(cè)量脊髓的信號(hào)強(qiáng)度（平均ROI）評(píng)價(jià)和頸部外階段分碼方向，包括重影偽影。兩種獲得的變量的區(qū)別在于在同一圖像中。
組織病理學(xué)的檢查：
在MR圖像研究后，所有大鼠被處死用來(lái)做組織病理學(xué)檢查。所有的動(dòng)物用4%的甲醛主動(dòng)脈內(nèi)灌注固定。頸脊柱被取下，并固定在相同溶液中1周。標(biāo)本用0.5m乙二胺酸脫鈣，和用石標(biāo)準(zhǔn)程序蠟包埋。光學(xué)顯微鏡下標(biāo)本從C2到C7，頭段到尾端橫斷面切除，共600片，每片5μm厚。每個(gè)的第10片尼氏染色，在每個(gè)染色片段顯微拍照包含整個(gè)腹角。
運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，被識(shí)別出有大核仁，以及發(fā)育好的致密染色的尼氏體。核仁，正常中央，包含與周圍的細(xì)胞核正常分界。為了獲得，。為了獲得**的神經(jīng)元計(jì)數(shù)，沒(méi)有遺漏或重復(fù)，我們選擇切片5μm厚度，留下5微米的距離，基于以下立體考慮：典型的大核仁直徑大約5μm，而且這個(gè)直徑是一致；選擇切片的厚度和間隔厚度5μm球形核仁，這意味著每個(gè)切片將包含核仁的完整輪廓，他們的中央在在切片之外2.5μm之內(nèi)。因此計(jì)數(shù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的核仁，這些核仁出現(xiàn)在5μm厚度的視野中，這些核仁中央局限在5μm之內(nèi)在每個(gè)切片中央的每邊上，因此在切片間留5μm的間隔意味著立體計(jì)數(shù)能夠避免運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目的遺漏或者重復(fù)。
統(tǒng)計(jì)分析：
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：數(shù)據(jù)用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)誤表達(dá)。BBB評(píng)分，*大跑步機(jī)速度，感覺(jué)評(píng)價(jià)，MR圖像研究的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)目運(yùn)用非參數(shù)比較（Wilcoxon’s rank sum test），用spss11。p＜0.05.
結(jié)果：術(shù)后，動(dòng)物均體健，無(wú)任何感染。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12個(gè)月的生存率分別在76.9%和71.4%。它們的體重增長(zhǎng)快速，從手術(shù)時(shí)的51+-1.1克，三個(gè)月后到481.7 – 14.7 g (control rats), or to465.0 – 19.8 g (CCS model rat)。隨后，兩組體重均增加，12個(gè)月后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組體重分別增加至706.7 – 43.2 g and 679.1 – 43.9 g。兩組生長(zhǎng)無(wú)顯著差異。
神經(jīng)功能結(jié)果：
在術(shù)后3,6,9,12個(gè)月時(shí)，檢測(cè)神經(jīng)功能。在3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，沒(méi)有大鼠出現(xiàn)脊髓病癥狀，BBB評(píng)分和*大跑步機(jī)速度類似于對(duì)照組。10只實(shí)驗(yàn)組的大鼠中的2只出現(xiàn)了BBB評(píng)分和*大跑步機(jī)速度下降，術(shù)后12個(gè)月，所有實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物均出現(xiàn)了脊髓病癥狀。術(shù)后12個(gè)月實(shí)驗(yàn)組BBB評(píng)分實(shí)驗(yàn)組（17.3 –+ 1.6)低于對(duì)照組的(20.8 +– 0.4)，實(shí)驗(yàn)組的*大跑步機(jī)速度(21.7 – +4.5m/min)，低于對(duì)照組的(33.3 –+3.5m/min)。在von frey 纖維測(cè)試中，實(shí)驗(yàn)組的大鼠有著和對(duì)照組大鼠類似的過(guò)程，一直到術(shù)后6個(gè)月。3只出現(xiàn)了前肢和后肢的輕微的感覺(jué)麻木。隨后，12個(gè)月后，所有的實(shí)驗(yàn)組模型，前肢的反應(yīng)頻率下降了(26.0 –+12.6%),后肢的反應(yīng)頻率下降了(21.0 –+ 23.8%)。
核磁共振:
核磁共振檢查在頸椎模型后3/6/12個(gè)月時(shí)進(jìn)行。在MR圖像上，從6個(gè)月開(kāi)始，CCS模型動(dòng)物的脊髓逐漸變平，一直惡化至12個(gè)月時(shí)。從脊髓矢狀位T1像獲得的脊髓橫截面積減少，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目的減少。（表1和圖片5）。在所有的CCS模型大鼠白質(zhì)顯示髓鞘破壞，和海綿狀軸索退變。病理改變發(fā)生主要在壓縮區(qū)域下方。
組織病理結(jié)果：一種慢性頸段脊髓壓迫的大鼠模型的建立：神經(jīng)功能行為、放射學(xué)及病理結(jié)果的變化
討論：
頸髓病是壓迫性脊髓病*嚴(yán)重的后果，例如椎關(guān)節(jié)強(qiáng)硬，韌帶骨化，椎管狹窄，和椎間盤突出癥，但是他的病理細(xì)節(jié)沒(méi)有被理解。一個(gè)原因就是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的滿意的慢性頸脊髓受壓模型沒(méi)有建立起來(lái)。目前為止，大量的方法運(yùn)用于產(chǎn)生脊髓壓迫損傷；不管怎么樣，大多數(shù)有有用的模型僅僅適用于急性或亞急性壓迫損傷，運(yùn)用錐板切除形成脊髓損傷，因此硬脊膜組織，血管損傷和**組織形成。沒(méi)有合適動(dòng)物模型用來(lái)分析慢性頸髓壓迫的效應(yīng)。其他模型，包括腫瘤細(xì)胞的移植，螺釘?shù)臐u進(jìn)性擰緊，擴(kuò)張性薄片的移植，脊柱韌帶骨化基因大鼠。這些模型有一些缺點(diǎn)，例如腫瘤模型生長(zhǎng)過(guò)快，硬膜外組織損傷在直接薄片或者螺釘移植、基因敲出小鼠壓迫點(diǎn)缺乏選擇性，可能發(fā)生在C1-C2以外的椎體。在我們模型，聚乙烯線利用椎管本身的生長(zhǎng)，深陷在擴(kuò)大的椎管中，這將漸進(jìn)性脊髓壓迫。產(chǎn)生頸髓壓迫，而沒(méi)有在椎管上實(shí)施手術(shù)，因此硬膜外組織沒(méi)有損傷，錐板切除的**組織沒(méi)有發(fā)生。大鼠和人類的骨成熟分別是大約3-4個(gè)月大，和13-16歲大。大鼠和人類的脊髓生長(zhǎng)完成大約在出生后3個(gè)月和18歲因此，3周大小的大鼠和12個(gè)月相對(duì)應(yīng)與人類的青少年和老年。一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了人類的壓迫性脊髓的形態(tài)學(xué)在CT或者M(jìn)RI影像與臨床癥狀的關(guān)系。據(jù)報(bào)道，如果通過(guò)CT影像學(xué)和核磁共振成像確診時(shí)脊髓橫截面積少于55-75%時(shí)，脊髓就不能耐受。另外，人類頸髓壓迫的典型特點(diǎn)是，在引起脊髓壓迫后，臨床癥狀出現(xiàn)的的隱匿性和延遲性。在本項(xiàng)研究中，頸髓壓迫沒(méi)有導(dǎo)致脊髓的急性的持續(xù)的神經(jīng)功能障礙。所有的動(dòng)物在術(shù)后都恢復(fù)了正常的神經(jīng)功能狀態(tài)。在核磁共振圖像上，頸椎管狹窄的脊髓逐漸扁平，從術(shù)后6個(gè)月開(kāi)始。

結(jié)論：本研究建立了一種新的有效的，沒(méi)有直接損傷大鼠脊髓的慢性頸髓壓迫模型。在本實(shí)驗(yàn)中，用聚乙烯線捆扎C4椎體的大鼠在9個(gè)月后出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)障礙及感覺(jué)障礙；但是，直到6個(gè)月時(shí)才出現(xiàn)臨床癥狀。這種隱匿性和延遲的癥狀正是脊髓慢性壓迫的*典型的特點(diǎn)之一。因此，本模型或許復(fù)制了人類慢性頸部脊髓壓迫的過(guò)程。